Первичная и вторичная альтерация вещества спинного мозга, развивающаяся в результате его травмы, сопровождается возникновением очага первичного некроза и формированием зоны вторичного повреждения [1, 5].
Вторичное повреждение спинного мозга в результате апоптоза приводит к отсроченной гибели активных нейронов и глиальных клеток [3]. Апоптоз нейронов и глиальных клеток инициируется сосудистыми нарушениями, иммунологическими реакциями, оксидативным стрессом, кальциево-глутаматным конфликтом, приводящими к отеку и повреждению клеточных мембран нейроцитов и олигодендроцитов [4]. Наряду с вторичным повреждением функциональной паренхимы происходит альтерация белковых компонентов межклеточного матрикса и гемато-спинномозгового барьера за счет активации продукции нейтрофильными лейкоцитами, глиальными макрофагами и Т-лимфоцитами металлопротеиназ, обусловленной эксайтотоксичностью и гиперцитокинемией (фактор некроза опухоли, интерлейкины 1β, 6) [9]. Матриксные металлопротеиназы также увеличивают лейкоцитарную инфильтрацию нервной ткани, деградацию миелиновых волокон, клеточную миграцию и подвижность астроцитов, приводя к ускоренному рубцеванию глиальной ткани [8].
Механизмы вторичного повреждения нервной ткани в посттравматическом периоде лимитируются усилением продукции паренхиматозной микроглией цитокинов, факторов роста нервной ткани и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ [7, 10]. Последние определяют возможность внутриклеточной регенерации нейронов, ремиелинизации нервных волокон и баланс между деструкцией и формированием межклеточного матрикса [6].
Соотношение клеточных механизмов резорбции и ремоделирования нервной ткани в посттравматическом периоде определяет суммарное количество активных нейронов, глиальных клеток и межклеточного матрикса в поврежденном спинном мозге, определяя конечный функциональный результат [2].
Цель – на основании сопоставительного анализа содержания нейроспецифических белков и маркеров межклеточного матрикса в сыворотке крови пациентов с осложненными повреждениями шейного отдела позвоночника выявить патофизиологически значимые корреляции, характеризующие ремоделирование нервной ткани в посттравматическом периоде.
Материал и методы исследования
Объектом исследования явились 40 пациентов обоего пола в возрасте 24 ± 7,5 лет с осложненными травматическими повреждениями шейного отдела позвоночника, находившихся в клинике нейрохирургии ФГБУ «СарНИИТО» Минздрава России в период с 2011 по 2013 гг. Все пациенты поступили в стационар в течение 1–4 суток с момента получения травмы и были сопоставимы по механизму повреждений и степени выраженности неврологического дефицита (класс А, В по шкале Frankel). Контрольную группу составили 40 условно здоровых лиц, также сопоставимых по полу и возрасту.
В обеих группах обследованных в утренние часы и натощак при пункции локтевой вены осуществляли взятие проб крови в объеме 5 мл. Кровь оставляли для свертывания при комнатной температуре, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут для получения сыворотки. Методом иммуноферментного анализа изучали количественное содержание в сыворотке крови нейроспецифических белков – фосфорилированного нейрофиламента-Н (pNF-H), (Buhlmann, Switzerland), основного белка миелина (MBP), (BioVendor, Crech Republic), нейротрофина-3 (NT-3), (Ray Bio Human), нейротрофина-4/5 (NT-4/5), (Ray Bio Human) и маркеров межклеточного матрикса – матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2), (R and D Systems, Inc. Human), матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9) (Bender MedSystems, BMS2016 h), тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 (TIMP-1), (Bender MedSystems, BMS2018 h). Исследования нейроспецифических белков и маркеров межклеточного матрикса в сыворотке крови в исследуемой группе осуществляли на 1-4-е, 7-е, 14-е, 21-е и 30-е сутки с момента получения травмы, в контрольной группе – однократно.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS 20 Statistics. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро ‒ Уилкса). Большинство наших данных не соответствовало закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовали непараметрические критерии (U-критерий Манна ‒ Уитни). Сопоставительный анализ статистически значимых показателей проводили с помощью определения коэффициента корреляции рангов Спирмена (R). Рассчитывали показатель достоверности (р), который определяли как статистически значимый при значениях р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
У больных с осложненной травмой шейного отдела позвоночника при определении содержания нейроспецифических белков – маркеров альтерации нервной ткани и маркеров межклеточного матрикса были выявлены некоторые корреляции (табл. 1).
Таблица 1
Корреляции содержания маркеров альтерации нервной ткани и маркеров межклеточного матрикса в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга
|
Маркеры альтерации нервной ткани |
Маркеры межклеточного матрикса |
Сутки наблюдения |
||||
|
1–4-е |
7-е |
14-е |
21-е |
30-е |
||
|
pNF-H, пг/мл |
MMP-2, нг/мл |
R = –0,107 р = 0,512 |
R = 0,253 р = 0,116 |
R = –0,059 р = 0,719 |
R = 0,063 р = 0,699 |
R = 0,057 р = 0,727 |
|
MMP-9, нг/мл |
R = 0,372 р = 0,030 |
R = 0,425 р = 0,042 |
R = –0,007 р = 0,965 |
R = 0,418 р = 0,007 |
R = 0,377 р = 0,016 |
|
|
TIMP-1, пг/мл |
R = 0,080 р = 0,625 |
R = ‒0,386 р = 0,043 |
R = ‒0,155 р = 0,036 |
R = 0,316 р = 0,024 |
R = 0,483 р = 0,043 |
|
|
MBP, нг/мл |
MMP-2, нг/мл |
R = 0,479 р = 0,049 |
R = 0,327 р = 0,041 |
R = 0,429 р = 0,045 |
R = 0,119 р = 0,464 |
R = ‒0,209 р = 0,194 |
|
MMP-9, нг/мл |
R = –0,151 р = 0,354 |
R = -0,003 р = 0,986 |
R = –0,136 р = 0,403 |
R = 0,376 р = 0,047 |
R = 0,430 р = 0,043 |
|
|
TIMP-1, пг/мл |
R = 0,365 р = 0,021 |
R = 0,025 р = 0,879 |
R = 0,464 р = 0,003 |
R = 0,118 р = 0,469 |
R = –0,316 р = 0,047 |
|
Примечания: R – коэффициент корреляции рангов Спирмена; p – показатель достоверности.
Сопоставительный анализ уровня pNF-H и ММР-9 свидетельствовал о наличии положительных средней силы корреляций на 1‒7-е и 21‒30-е сутки с момента получения травмы (р < 0,05). Содержание pNF-H и TIMP-1 коррелировало отрицательно со средней силой на 7-е сутки и со средней силой – на 14-е сутки с момента травмы (р < 0,05). На 21-е и 30-е сутки обнаруживались средней силы положительные корреляции концентраций pNF-H и TIMP-1 (р < 0,05). Статистически значимых корреляций между содержанием pNF-H и ММР-2 во все сроки наблюдения выявлено не было.
Изучение взаимосвязи между содержанием MBP и ММР-2 выявило наличие средней силы положительных корреляций на 1-е, 7-е и 14-е сутки с момента получения травмы (р < 0,05). Содержание MBP и ММР-9 положительно со средней силой коррелировало лишь на 30-е сутки наблюдения (р < 0,05). Содержание MBP и TIMP-1 коррелировало положительно со средней силой на 1‒4-е и 14-е сутки и отрицательно со средней силой – на 30-е сутки с момента травмы (р < 0,05).
При изучении содержания нейроспецифических белков – маркеров регенерации нервной ткани и маркеров межклеточного матрикса ‒ также были выявлены некоторые корреляции (табл. 2).
Обнаружены средней силы положительные корреляции между содержанием NT-3 и TIMP-1 на 1‒4-е, 14-е и 21-е сутки с момента травмы (р < 0,05). Каких-либо корреляций содержания исследуемого нейроспецифического белка и ММР-2, ММР-9 выявлено не было.
Оценка содержания NT-4/5 не выявила корреляций с уровнями ММР-2 во все периоды наблюдения. Уровень NT-4/5 со средней силой отрицательно коррелировал с показателем содержания ММР-9 лишь на 21-е сутки с момента травмы (р < 0,05).
Сопоставительный анализ концентраций NT-4/5 и TIMP-1 свидетельствовал о наличии положительных средней силы корреляций на 7–14-е сутки (р < 0,05).
Согласно современным представлениям, травматическое повреждение вещества спинного мозга сопровождается апоптотической гибелью активных нейронов и глиальных клеток. Альтерация клеточных мембран нейронов приводит к высвобождению цитоплазматических нейроспецифических белков в спинномозговую жидкость и системный кровоток, что, наряду с другими метаболитами и биологически активными веществами, инициирует транскрипцию факторов роста нервной ткани, оказывающих трофные и тропные влияния в зоне вторичного повреждения. Наряду с повреждением клеточных элементов нервной ткани происходит обусловленная преимущественно механическим повреждением деструкция белковых компонентов межклеточного матрикса и гемато-спинномозгового барьера за счет стимуляции транскрипции матриксных металлопротеиназ, способствующих резорбции нервной ткани и формированию грубого глио-мезодермального рубца. Ограничивают данный процесс тканевые ингибиторы металлопротеиназ, которые блокируют разрушение экстрацеллюлярного матрикса, стимулируют клеточную пролиферацию и ангиогенез. Данные процессы составляют основу ремоделирования нервной ткани в посттравматическом периоде [2].
Таблица 2
Корреляции содержания маркеров регенерации нервной ткани и маркеров межклеточного матрикса в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга
|
Маркеры регенерации нервной ткани |
Маркеры межклеточного матрикса |
Сутки наблюдения |
||||
|
1–4-е |
7-е |
14-е |
21-е |
30-е |
||
|
NT-3, пг/мл |
MMP-2, нг/мл |
R = 0,067 р = 0,683 |
R = –0,166 р = 0,305 |
R = 0,036 р = 0,824 |
R = –0,044 р = 0,789 |
R = –0,024 р = 0,881 |
|
MMP-9, нг/мл |
R = ‒0,094 р = 0,562 |
R = 0,063 р = 0,701 |
R = ‒0,158 р = 0,330 |
R = ‒0,089 р = 0,583 |
R = –0,102 р = 0,533 |
|
|
TIMP-1, пг/мл |
R = –0,310 р = 0,041 |
R = 0,166 р = 0,306 |
R = 0,371 р = 0,041 |
R = 0,304 р = 0,047 |
R = 0,018 р = 0,913 |
|
|
NT-4/5, пг/мл |
MMP-2, нг/мл |
R = ‒0,185 р = 0,254 |
R = 0,106 р = 0,514 |
R = –0,052 р = 0,748 |
R = 0,122 р = 0,455 |
R = 0,159 р = 0,329 |
|
MMP-9, нг/мл |
R = 0,188 р = 0,246 |
R = 0,030 р = 0,853 |
R = ‒0,078 р = 0,633 |
R = ‒0,374 р = 0,047 |
R = –0,020 р = 0,901 |
|
|
TIMP-1, пг/мл |
R = 0,271 р = 0,032 |
R = 0,471 р = 0,031 |
R = 0,378 р = 0,033 |
R = 0,052 р = 0,749 |
R = 0,137 р = 0,400 |
|
Примечания: R – коэффициент корреляции рангов Спирмена; p – показатель достоверности.
Сопоставительный анализ корреляций содержания маркеров альтерации нервной ткани и межклеточного матрикса позволил выявить некоторые закономерности. Полученные нами данные свидетельствуют о наличии положительных корреляций уровней pNF-H и MMP-9 на 1-7-е и 21-30-е сутки посттравматического периода, что, по нашему мнению, совпадает с данными литературы о сроках развития стадий реализации апоптоза и удаления погибших клеток. Исполнителями на этих стадиях являются не только эндонуклеазы и эффекторные каспазы, но и матриксные металлопротеиназы [3].
Наличие отрицательных корреляций содержания pNF-H и TIMP-1 на 7-е и 14-е сутки после травмы, на наш взгляд, обусловлено относительной недостаточностью продукции TIMP-1, что отдельными авторами связывается с усилением его потребления в период максимальной деструкции нервной ткани, локализующейся преимущественно в зоне первичного повреждения [8]. Появление положительных корреляций между концентрацией pNF-H и TIMP-1 на 21–30-е сутки, вероятно, связано с усилением транскрипции TIMP-1 в ответ на прогрессирующую деструкцию аксонов (нервных волокон) вследствие вторичного повреждения вещества спинного мозга, что соответствует данным [4].
Отсутствие каких-либо корреляций между уровнями pNF-H и ММР-2 мы связываем с ингибированием инициации транскрипции ММР-2 в условиях отсутствующей регенерации клеточных компонентов нервной ткани, о чем имеются сведения, приводимые в работе [2].
Обнаруженные нами положительные корреляции между уровнями MBP и ММР-2 на 1–14-е сутки после травмы свидетельствуют о выраженности процессов демиелинизации аксонов (нервных волокон), обусловленной деструкцией белковых компонентов миелина под воздействием матриксных металлопротеиназ. Аналогичные сведения приведены в работе [7].
Появление положительных корреляций MBP и ММР-9 к 30-м суткам наблюдения, вероятно, связано с описываемой в литературных источниках мобилизацией матрикс-связанных факторов роста и процессингом цитокинов, обусловливающих ремиелинизацию нервных волокон и ремоделирование межклеточного матрикса [8].
Положительные корреляции MBP и TIMP-1 на 1–4-е и 14-е сутки обусловлены активизацией процессов демиелинизации нервных волокон, когда повышение активности TIMP-1 направлено на санацию нервной ткани от клеточного детрита и предупреждения его попадания в межклеточный матрикс. Активация ремиелинизации нервных волокон к 30-м суткам наблюдения совпадает со снижением активности TIMP-1, что было обнаружено нами в виде отрицательной корреляции к 30-м суткам.
Сопоставительный анализ маркеров регенерации нервной ткани и маркеров межклеточного матрикса выявил наличие положительных взаимосвязей между уровнями содержания NT-3 и TIMP-1 на 1‒4-е, 14-е и 21-е сутки, что совпадало с периодами максимального повышения концентрации NT-3. Согласно данным литературы это является одним из саногенетических механизмов, направленных на повышение чувствительности нервной ткани к действию нейротрофических факторов при условии максимального очищения ее от клеточного детрита и восстановления структуры межклеточного матрикса [8, 10].
Выявленная на 21-е сутки посттравматического периода отрицательная корреляция между уровнями NT-4/5 и ММР-9, на наш взгляд, также может свидетельствовать об инициации под влиянием ММР-9 клеточной пролиферации.
Отсутствие каких-либо корреляций между уровнями NT-3, NT-4/5 и ММР-2, ММР-9, возможно, может свидетельствовать о преобладании внутриклеточной регенерации над резорбцией нервной ткани, однако сведений по этому вопросу в доступной литературе мы не обнаружили.
Выводы
1. Процесс ремоделирования спинного мозга в остром и раннем периодах травматической болезни определяется совокупностью механизмов альтерации и регенерации нервной ткани, направленность и выраженность которых может характеризоваться динамическими изменениями содержания нейроспецифических белков и маркеров межклеточного матрикса в биологических субстратах.
2. Положительные корреляции содержания pNF-H и ММР-9, выявленные на 1–4-е, 7-е, 21-е и 30-е сутки, pNF-H и TIMP-1 на 21-е и 30-е сутки, МВР и ММР-2 – на 1–4-е, 7-е и 14-е сутки, МВР и TIMP-1 – на 1–4-е и 14-е сутки и отрицательные, между уровнями pNF-H и TIMP-1 на 7-е и 14-е сутки характеризуют преобладание механизмов клеточной альтерации нервной ткани и являются патогенетически значимыми при травматической болезни спинного мозга.
3. Выявленные на 1–4-е, 14-е, 21-е сутки положительные корреляции содержания NT-3 и TIMP-1 и отрицательные – NT-4/5 и ММР-9 на 21-е сутки свидетельствуют о преобладании механизмов внутриклеточной регенерации нервной ткани и являются саногенетически значимыми при ее ремоделировании в посттравматическом периоде.
Рецензенты:Щуковский В.В., д.м.н., профессор, ГУЗ «Перинатальный центр», г. Саратов;
Слободской А.Б., д.м.н., заведующий отделением ортопедии ГУЗ «Областная клиническая больница», г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 02.02.2015.