Известно, что для всех аэробных организмов, включая человека, молекулярный кислород является жизненно необходимым, выступая конечным акцептором электронов в митохондриальной дыхательной цепи и играя принципиальную роль в синтезе АТФ из АДФ. Частично восстановленные и высокореактивные кислородные метаболиты могут образовываться в последней и других реакциях электронно-транспортной цепи. В спектр этих метаболитов входят супероксид-анион радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал. Указанные вещества вместе с иными окислительными агентами (в частности, гипохлорит, синглетный кислород и др.) именуются «активными формами кислорода» (АФК). С учетом того, что АФК способны вызывать окислительную модификацию липидов, белков и ДНК, в клетках существует ряд защитных механизмов, прежде всего представленных антиоксидантными ферментами и специфическими путями деградации. На этом основании «окислительный стресс» может быть определен как дисбаланс между продукцией АФК и антиоксидантным потенциалом клеток. Согласно современным представлениям, оксидативный стресс является компонентом различных заболеваний человека, в том числе онкологических, а также играет роль в процессах старения [1]. В настоящее время большой интерес представляют также физиологические функции активных форм азота (АФА), в частности, монооксида азота (NO) как универсального мессенджера в сердечно-сосудистой, нервной и иммунной системах [2], а также пероксинитрита (ONOO-) как молекулы, инициирующей развитие нитрозативного стресса. В связи с этим необходимы специфичные и чувствительные методы изучения продукции АФК и АФА для оценки их роли в организме [3, 4].
Следует отметить, что подобные методы анализа состояния отдельных клеток и организма в целом характеризуются малоинвазивностью без необходимости получения клеточного материала [4]. Эти технологии, позволяющие визуализировать физиологические и патофизиологические сдвиги, приобрели особое значение в биомедицинских науках.
По сравнению с другими методами диагностики (радиоизотопное исследование, МРТ, электронный парамагнитный резонанс, электрохимическая детекция) флуоресцентный имаджинг имеет существенно большую чувствительность, малоинвазивность и позволяет в дальнейшем анализировать результаты различными способами. Дополнительным преимуществом флуоресцентной детекции является то, что флуоресцентный сигнал молекулы-детектора принципиально изменяется, причем сам зонд активируется, но не накапливается в биообъекте, а может быть удален. Флуоресцентные зонды представляют собой небольшие органические молекулы, которые позволяют получить динамическую информацию о локализации и количестве интересующих исследователя молекул, нивелируя необходимость применения технологий генной инженерии в отношении анализируемого образца. В последние годы различные стратегии использования флуоресцентных зондов, включая фотоиндуцированный перенос электронов, флуоресцентно-резонансный энергетический трансфер, метод внутримолекулярного обмена и спироциклизация, хорошо изучены и применяются в отношении различных зондов. Для АФК и АФА подобные флуоресцентные зонды – это молекулы, специфически реагирующие с ними и обеспечивающие изменение их фотохимических свойств (интенсивность флуоресценции, длину волны поглощения/эмиссии и др.) [5].
Краткий обзор биологической роли кислорода
Трудно переоценить значимость определения уровня молекулярного кислорода, обеспечивающего клеточное дыхание организма. В связи с этим детальное понимание биологической роли соединения представляет собой важную фундаментальную и прикладную проблему [6, 7]. Являясь ключевым метаболитом и источником энергии для клеток млекопитающих, кислород используется для синтеза АТФ в электронно-транспортной цепи и процессах окислительного фосфорилирования. Также он служит субстратом многочисленных энзиматических реакций, обеспечивающих адекватное функционирование клеток. С другой стороны, кислород способен играть и сигнальную роль в адаптации к гипоксии с вовлечением механизмов, ассоциированных с гипоксия-индуцированным фактором [8].
Физико-химические свойства молекулярного кислорода
Как известно, молекулярный кислород представляет собой малую неполярную молекулу, находящуюся в газообразном состоянии и обладающую умеренной растворимостью в жидкостях (около 200 мкМ при 37 °С). Он поступает к клеткам путем пассивной диффузии и, у высших многоклеточных организмов, конвективного транспорта через сосудистую стенку из гемоглобина эритроцитов [3, 8].
К числу наиболее практически значимых измеряемых показателей в отношении молекулярного кислорода в биологических объектах принято относить:
– уровень оксигенации in situ;
– показатель сатурации эритроцитов;
– градиент концентраций кислорода в тканях.
Следует подчеркнуть, что измерение указанных параметров в динамике позволяет оценивать функционирование клеток и клеточных пулов.
В физиологических условиях значения рассматриваемых показателей гомеостазируются в достаточно узких пределах, причем существенные отклонения могут наблюдаться только в активно работающих мышцах, ткани мозга и возбудимых тканях. Уровень потребления тканями кислорода отражает активность процессов клеточного дыхания в биообъекте и, в комплексе с концентрацией АТФ, ионов и метаболитов и мембранным потенциалом митохондрий, характеризует биоэнергетический статус клетки. Отклонение данного показателя от нормы служит индикатором метаболических нарушений, митохондриальной дисфункции и патологии в целом [9]. Аналогично этому, сдвиги клеточной или тканевой оксигенации связаны с целым рядом патологических состояний, включая инсульты, онкологические заболевания, патологию неврологического профиля, метаболическую дисфункцию и др. Известно, что как кратковременная, так и длительная гипоксия приводит к перестройке клеточного метаболизма, приводящего либо к гибели клетки, либо к формированию стресс-ответа (за счет эффекта Варбурга – экспрессии индуцированных гипоксией факторов, таких как HIF-1ά,RGC-1ά и т.д.) [8, 10, 11].
Обзор технологий, направленных на определение параметров оксигенации биологических образцов
Область, связанная с разработкой методов измерения параметров оксигенации биологических объектов, развивается уже на протяжении многих лет. Первоначально ее формирование инициировалось внедрением в исследования кислородных электродов Кларка [12], специальных фотометрических (с использованием миоглобина) [13, 14] и ЭПР-систем [15], продемонстрировавших свою информативность для фундаментальных исследований в сфере изучения процессов биоэнергетики, метаболизма, клеточной биологии и токсикологии. Следует отметить, что применение данных методов позволило использовать простые макроскопические модели. В частности, с их помощью были изучены характеристики изолированных митохондрий, суспензий клеток и проведен ряд исследований in vivo [12].
В дальнейшем возможности детектирующих систем были существенно расширены за счет микроэлектродов [16–18], систем для смежных клеток [19], ЭПР-зондов [20], 19F-изотопных исследований [21], применения пимонизадола в качестве красителя [22], фибро-оптических сенсоров [23], а также было улучшено техническое обеспечение ранее разработанных инструментальных методов.
Принципиально новой технологией, впервые предложенной Д. Вилсоном с соавт. (1988) [24], явилось применение биологических О2-сенсоров, основанных на гашении фосфоресценции и использовании растворимых зондов. В последнее десятилетие данные диагностические системы совершили революцию в отношении целого ряда химических сенсоров, методологии измерения и инструментального обеспечения, позволяя решать новые аналитические и прикладные задачи. Кроме того, были предложены несколько новых оптических сенсорных методов, включая исследование кислород-зависимой флуоресценции GFP-комплексов [25] и визуализацию поздней флуоресценции [26]. С учетом того, что в настоящее время приведенные технологии перестают быть уделом единичных лабораторий, существующие платформы для оптической детекции и визуализации кислорода в биологических образцах приобретают специфические характеристики и технические параметры, требующие глубокого понимания областей их применения и обоснованности выбора тех или иных диагностических технологий.
Биомедицинские приложения методов определения кислородного гомеостаза биологических объектов
Показано, что среднее потребление кислорода/концентрация O2 могут быть измерены с использованием внеклеточных кислородных зондов, вводимых в анализируемый образец. Подобные исследования могут быть проведены в кюветах или микропланшетах с помощью стандартных флуоресцентных или времяпролетных спектрометров [9, 21]. Для оценки абсолютного уровня поглощения тканями кислорода должны использоваться запечатанные, газонепроницаемые пробирки [27]. В случае, если биологический образец содержит гетерогенное или преципитирующееся вещество (например, клеточную суспензию), должна быть проведена гомогенизация для исключения образования локального кислородного градиента и искажения результата анализа.
При наличии задачи определения относительного уровня потребления кислорода (между обработанными каким-либо воздействием и интактными клетками) требования к методами исследования могут быть упрощены, в частности, за счет использования стандартных микропланшет, которые не препятствуют росту клеток, трансмембранному транспорту жидкостей и др.; а также частичного запечатывания образцов добавлением минеральных масел в ячейку перед измерением [27]. Масло создает барьер для поступления кислорода в образец из окружающей среды и приводит к формированию градиента концентрации соединения в нем, который может быть оценен с помощью зондов и соотнесен с уровнем потребления кислорода [28]. Подобный подход наиболее применим в отношении скрининга большого количества аналогичных образцов (составление библиотек состояния митохондрий и цитотоксичности при различных воздействиях, анализ панелей трансформированных клеток и микробных культур). Для этих целей может использоваться простое измерение интенсивности флуоресценции с соответствующим контролем для исключения потенциальных артефактов оптической интерференции и измерения.
Исследование кислородного статуса in vivo имеет большое фундаментальное и прикладное значение. Оценка текущего уровня оксигенации в живых активно функционирующих тканях (например, в мозге или мышцах), кислородный градиент в сосудистом русле (крупных сосудах и капиллярной сети) и опухолях может быть проведена с использованием внеклеточных зондов и фосфоресцентного кислородного имаджинга в реальном времени [29]. Также для данных задач могут быть применены фибро-оптические зонды и измерение «от точки к точке» [30]. В последние годы для мониторирования оксигенации тканей успешно используются широкопольные системы флуоресцентной микроскопии в реальном времени (FLIM) и конфокальные лазерно-сканирующие комплексы высокого разрешения [31]. Следует отметить, что указанные методы в комплексе могут быть применены при исследованиях in vivo и ex vivo.
Кроме того, расширяется «ассортимент» новых дендримерных зондов с кумариновыми антеннами, применяемых для измерения локальной оксигенации участков мозга грызунов с помощью специально подготовленных двухфотонных FLIM-систем [32]. Для этой цели не проникающий в клетки зонд PtP-C343 вводят в кровоток и детектируют его в ткани мозга на различных расстояниях от артерий [33]. Эта система позволяет добиться пространственного разрешения 10 мкм, а стабильность ее калибровки по кислороду практически не зависит от условий окружающей среды, тогда как период полужизни зонда в организме – 2 ч.
Другие известные исследования параметров оксигенации тканей in vivo включают [3]:
– картирование оксигенации радужной оболочки глаза грызунов при действии анестетиков, снижающих венозное давление кислорода [30];
– динамику оксигенации в отдельных скелетных мышечных волокнах лягушки, что позволило установить адаптивное повышение парциального давления кислорода в них при высокочастотной стимуляции;
– измерение парциального давления кислорода в микроциркуляторном русле;
– особенности кислородного статуса опухолей;
– проведение FLIM-анализа кортикального внесосудистого кислорода при моделировании ишемии-реперфузии.
Совершенствование внутриклеточных кислородных зондов позволило существенно расширить возможности детектирования кислорода, в том числе с учетом in situ оксигенации активно функционирующих тканей. Так, адгезированные клетки в их естественном дифференцированном состоянии могут быть изучены в открытых микропланшетах или в запечатанном виде (перфузируемые клетки или клеточные культуры). В этих случаях основными контролируемыми и оптимизируемыми параметрами являются плотность клеток и их метаболическая активность, характеристики диффузии и массообмена в образце (объем среды, вязкость и температура), а также парциальное давление кислорода во внешней среде [28]. Внутриклеточные зонды могут быть применены совместно с флуоресцентной времяпролетной спектрометрией для упрощения, удобства и минимизации объема образца и оптимизации результата анализа. Приведенная исследовательская методология дает возможность отслеживать сдвиги клеточного дыхания и метаболизма, ответ клеток на стимуляцию различными эффекторами (в том числе – в динамике самого измерения) и на гипоксию [28]. Она уже была применена в нескольких работах с использованием сложных биологических систем [34].
Внутриклеточные зонды также могут быть применены в микроскопической визуализации для задач полуколичественного отслеживания клеточного кислорода, а также более точного выполнения FLIM-анализа [35]. В частности, они были использованы при проведении оценки кислородного статуса in situ скелетных мышц и для ex vivo визуализации исследования каротидного гломуса, в котором уровень оксигенации клеток коррелировал с другими показателями их функционирования.
Следует также заметить, что перфузионные камеры, микрожидкостные устройства и 3D-клеточные культуры приобрели большую популярность в биологических экспериментах [36]. Для подобных систем прямой контроль оксигенации в образцах затруднителен, в связи с чем может быть он выполнен только с применением внутриклеточных зондов и последующего бесконтактного измерения. Аналогично в отношении адгезированных клеток и тканей, находящихся в условиях, исключающих перемешивание (например, в микропланшетах под слоем масла), применение внутриклеточных зондов способно значительно повысить чувствительность исследования по сравнению с методами, основанными на внеклеточной детекции.
Наконец, принципиально возможны комбинации различных кислород-сенсорных зондов и технологий определения кислородного статуса в сложных биосистемах, в том числе в клеточных культурах, при тканевой инженерии или в экспериментах, проводимых в условиях гипоксической среды. Предложенные методы измерения включают [1, 3]:
– камеры для создания гипоксических условий (макро-системы), в которых имеется возможность моделировать различный уровень парциального давления кислорода;
– твердофазные кислородные сенсоры, помещаемые внутрь специальных камер;
– ручные оптические сканеры, получающие информацию с сенсоров, расположенных внутри и вне камеры, и учитывающие текущую концентрацию кислорода;
– пробирки-емкости для клеточных культур со встроенными сенсорными портами, также интегрирующимися с портативными сканерами;
– микропланшеты с клетками, содержащие дополнительно внутриклеточные или внеклеточные кислородные зонды (микросистемы);
– флуоресцентные времяпролетные спектрометры для микропланшет, способные оценивать уровень оксигенации и респираторного ответа клеточных популяций;
– системы визуализации, которые позволяют проводить детальный анализ отдельных клеток, клеточных популяций и живых тканей на высоком разрешении (наноуровень).
Заключение
В настоящее время описан и апробирован достаточно широкий спектр различных кислородных сенсоров, протоколов измерения и прикладных инструментов для его осуществления, причем каждый из них имеет свои преимущества и ограничения. Для того, чтобы адекватно подобрать и использовать их в отношении конкретной биологической модели или исследовательской задачи, необходимо оценить их аналитические возможности для рассматриваемых условий эксперимента, установить структурно-функциональные взаимоотношения и разработать детальный протокол измерения. Так, только некоторые из предложенных сейчас зондов и методов позволяют достичь качественной, стабильной и воспроизводимой оценки уровня кислородообеспечения клеток и тканей, а также точной калибровки. Многие другие подходы остаются на стадии доработки общей концепции метода, недостаточно оптимизированы, демонстрируют неудовлетворительные рабочие характеристики и аналитическую точность или позволяют получить только полуколичественные данные (относительные сдвиги концентрации кислорода или требуют контрольного уровня параметров). Это ограничивает их широкое использование специалистами в области биомедицины.
Другим лимитирующим фактором в распространении раскрываемых технологий является недостаточность представлений потенциальных пользователей данных методов о базисных принципах каждой конкретной технологии кислородного детектирования и возможностях оценки и грамотного описания результатов, полученных с их помощью. Это зачастую приводит к получению негативных данных и отрицанию информативности технологий, что затрудняет их внедрение в исследовательскую практику.
Для преодоления указанных затруднений и более широкого распространения методов, основанных на использовании кислородных зондов, которые разработаны в настоящее время в достаточно большом количестве, необходимы дополнительные предметные ориентированные изыскания, а также проведение сравнительного анализа их результатов в различных биологических экспериментах с демонстрацией их информативности и полезности в крупных физиологических, патофизиологических и клинических работах.
С практических позиций, фундаментальные изыскания в области биоэнергетики, метаболизма, клеточной биологии и токсикологии, выполненные с применением кислород-детектирующих технологий, более предпочтительны для исследования макроскопических образцов, таких как митохондриальные фракции клеток, суспензии клеточных линий и перфузируемые ткани [3]. В настоящее время акцент делается на анализе сложных моделей и биосистем в реальном времени: адгезированных дифференцированных клеток, ex vivo и in vivo систем (функционирующий мозг, мышечная ткань, ткань опухоли, сосудистое русло). Достижением последнего времени также следует считать детальное картирование и реконструкцию кислородного градиента как в микрошкалах, так и в 3D-варианте относительно целых тканей и даже отдельных клеток [26], требующие в дальнейшем основательной верификации. Предложенные визуализирующие платформы со «сверхразрешением» содержат в себе инновационные кислородные зонды с замедленным действием, что открывает принципиально новые перспективы для раскрытия кислородного метаболизма биосистем различного уровня.
Характеризуя значимость измерения концентрации кислорода и его градиента в тканях и клетках, следует отметить ценность этих сведений в таких областях биомедицины, как метаболизм опухолей, нейробиология, гипоксические состояния, клеточная физиология, разработка новой биомедицинской аппаратуры и заживление ран. Для макрообъектов, таких как фрагменты тканей, органов или целостный организм, кислородный статус также имеет принципиальное значение, в частности в отношении радио- и химиотерапии, репродуктивных технологий и трансплантации органов [37]. Требования к системам неинвазивного измерения концентрации кислорода важны для многих областей биомедицины и различных биомоделей. Также это имеет принципиальное значение для биотехнологии, мониторинга состояния окружающей среды, продуктов и контроля химических производств различного профиля и направленности.
Рецензенты:
Перетягин С.П., д.м.н., профессор, президент ассоциации Российских озонотерапевтов, г. Нижний Новгород;
Пахмутов И.А., д.в.н., профессор кафедры анатомии, хирургии и внутренних незаразных болезней, Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия, г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 28.12.2014.