Активные формы кислорода являются неотъемлемым звеном существования высших форм живых организмов. Отсутствие или сбой в образовании данных элементов сопровождается накоплением окислительных повреждений и возникновением окислительного стресса, который является составной частью целого ряда патологических процессов и заболеваний.
К нарушению функционирования систем организма могут приводить различные климатические, экологические и антропогенные факторы. Интенсивное загрязнение атмосферного воздуха в России приводит к ежегодной дополнительной смертности до 40 тыс. человек [8, 3]. Неблагоприятное воздействие низкой температуры среды, перепадов атмосферного давления, высокой ионизации воздуха и других факторов окружающей среды Севера нашей страны приводит к развитию и формированию патологии у человека [1].
В предыдущих исследованиях было выявлено значительное изменение процессов перекисного окисления липидов в зависимости от природно-климатических зон Омской области в различные периоды года [5]. Установлено более интенсивное течение свободнорадикального окисления в зимний период года по показателям молока хозяйств, расположенных в пригородных зонах промышленного центра, в отличие от северных и южных районов области [7]. Однако перемена времени года, изменение суточной ритмики и рациона кормления животных в летний период могут повлиять на интенсивность окислительной деструкции белков молока животных.
Цель работы – оценить интенсивность спонтанной и металлкатализируемой окислительной модификации белков молока крупного рогатого скота хозяйств лесной, степной и лесостепной зон Омской области в летний период года.
Материалы и методы исследования
Для исследования использовали сырое натуральное молоко коров, полученное от хозяйств, расположенных в лесостепной зоне (пригород Омска), лесной зоне (северные районы области) и степной зоне (южные районы области), нормализованное по массовой доле жира до 2,5 %.
Уровень спонтанной окислительной модификации белков (ОМБ) определяли методом, основанным на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином и образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Оценку металлкатализированного окисления белков молока проводили по содержанию карбонилированных белков при индуцировании свободнорадикального окисления системой Fe2+/H2O2. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали спектрофотометрически при следующих длинах волн: 274, 356, 370, 430 и 530 нм [2].
Определение доступных сульфгидрильных групп молока, сыворотки (супернатант после внесения уксусной кислоты – рН 4,6 и центрифугирования в течение 15 мин) и свободных доступных сульфгидрильных групп, полученных путем осаждения белков молока, основано на их взаимодействии с 5,5/-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБ) с образованием окрашенного дисульфида. Оптическую плотность проб определяли на спектрофотометре при длине волны 412 нм [9].
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Статистическая значимость межгрупповых различий оценивалась по критерию Манна – Уитни (U). Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости р = 0,05. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартиля – Ме (Q1; Q3).
Результаты исследования и их обсуждение
Содержание продуктов спонтанной ОМБ молока различается в разных эколого-географических зонах Омской области (табл. 1). Уровень альдегид-динитрофенилгидразонов (274 нм) – ранние маркеры окислительной деструкции белков – по данным Иванова В.В. с соавт. [4] в лесостепной зоне выше на 20 % (Р = 0,001) и 29 % (Р = 0,003) относительно лесной и степной зон области. Обнаружено повышение кетон-динитрофенилгидразонов основного характера (530 нм), являющихся маркерами поздней деструкции белков в лесостепной зоне (пригород) на 38 % (Р = 0,007) и 51 % (Р < 0,001) относительно лесной и степной зон соответственно. Выявлены различия в ОМБ молока лесной и степной зон области. В лесной зоне уровень кетон-динитрофенилгидразонов основного характера на 20 % (Р = 0,015) выше относительно степной зоны.
Таблица 1
Содержание карбонильных производных белков в летний период года, Ме (Q1;Q3)
|
Длина волны, нм |
Лесная зона n = 11 |
Степная зона n = 11 |
Лесостепная зона (пригород) n = 10 |
|
Спонтанная окислительная модификация белков (е.о.п. на 1 г белка) |
|||
|
274 |
134,91 (116,77; 160,57) |
119,16 (99,45; 145,83) |
168,71*х (164,43; 187,07) |
|
356 |
87,62 (71,69; 117,07) |
74,64 (72,79; 100,75) |
84,34 (80,61; 89,80) |
|
370 |
84,43 (70,59; 109,76) |
68,13 (52,14; 90,43) |
79,16 (74,79; 86,73) |
|
430 |
66,48 (59,17; 72,12) |
59,56 (54,40; 80,05) |
69,81 (66,91; 76,53) |
|
530 |
6,29 (5,93; 8,28) |
5,05* (4,27; 6,02) |
10,23*хх (7,91; 12,04) |
Примечания: * – статистически значимые отличия от лесной зоны; Р < 0,05, х – статистически значимые отличия от лесной зоны; Р < 0,05,хх – статистически значимые отличия от степной зоны, Р < 0,001.
Полученные результаты металлкатализируемой ОМБ свидетельствуют о повышении альдегид-динитрофенилгидразонов (274 нм) в молоке лесостепной зоны на 12 % (Р = 0,042) и 51 % (Р < 0,001) в сравнении с пробами молока от хозяйств лесной и степной природно-климатических зон (табл. 2). Обнаружено увеличение в лесостепной зоне уровня алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера (356 нм) на 30 % (Р = 0,042) и на 51 % (Р < 0,001), кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера (370 нм) на 25 % (Р = 0,041) и на 50 % (Р < 0,001), а также альдегид-динитрофенилгидразонов основного характера (430 нм) на 23 % (Р = 0,022) и на 37 % (Р < 0,001) по сравнению с лесной и степной зонами соответственно. Содержание кетон-динитрофенилгидразонов основного характера (530 нм) в лесостепной зоне повышено на 57 % (Р = 0,003) относительно лесной зоны области. Полученные результаты свидетельствуют о более интенсивном карбонилировании белков молока в пригороде Омска. Возможно, данный факт объясняется наличием различных крупных промышленных предприятий, выбросов автотранспорта и других потенциально опасных объектов, находящихся в непосредственной близости от исследуемых хозяйств лесостепной зоны. Воздействие данных загрязнений негативно влияет как на здоровье населения мегаполисов [6] так и на окружающие его организмы [3]. Проникая в организм человека и животных, химические вещества подвергаются ряду биохимических превращений, результатом которых является их обезвреживание и выведение из организма. В процессе обезвреживания данных веществ наблюдается увеличение образования свободных радикалов и активных форм кислорода, что приводит к свободнорадикальному окислению белков, липидов и ДНК в организме [10].
Таблица 2
Содержание металлкатализируемых карбонильных производных белков в летний период года, Ме (Q1;Q3)
|
Длина волны, нм |
Лесная зона n = 11 |
Степная зона n = 11 |
Лесостепная зона (пригород) n = 10 |
|
Индуцируемая окислительная модификация белков (е.о.п. на 1 г белка) |
|||
|
274 (Fe2+/H2O2) |
232,10 (204,44; 238,75) |
130,29** (125,00; 149,33) |
265,07*хх (234,69; 298,66) |
|
356 (Fe2+/H2O2) |
183,09 (177,57; 218,88) |
127,84** (116,91; 149,22) |
260,96*хх (230,45; 288,10) |
|
370 (Fe2+/H2O2) |
192,74 (186,65; 214,45) |
126,14* (118,38; 146,46) |
256,17*хх (213,49, 304,42) |
|
430 (Fe2+/H2O2) |
116,32 (110,26; 143,12) |
94,73* (77,81; 120,74) |
151,11*хх (134,9; 186,62) |
|
530 (Fe2+/H2O2) |
8,42 (7,05; 10,74) |
12,95* (10,24; 13,83) |
19,6* (10,80; 21,43) |
Примечания: * – статистически значимые отличия от лесной зоны, Р < 0,05 ,** – статистически значимые отличия от лесной зоны, Р < 0,001, Р < 0,05,хх – статистически значимые отличия от степной зоны, Р < 0,001.
Рис. 1. Содержание доступных сульфгидрильных групп в молоке разных природно-климатических зон Омской области (мкмоль/г)
В лесной зоне увеличено содержание альдегид-динитрофенилгидразонов (274 нм) на 44 % (Р < 0,001), альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера (356 нм) на 30 % (Р = 0,015), кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера (370 нм) на 35 % (Р = 0,011), альдегид-динитрофенилгидразонов основного характера (430 нм) на 19 % (Р = 0,019) относительно степной зоны. Содержание же кетон-динитрофенилгидразонов основного характера молоке в коров степной зоны на 35 % (Р = 0,035) выше по сравнению с лесной зоной. Соответственно можно выделить степную зону, в которой белки молока менее подвержены окислительной модификации. Возможно, это связано с более насыщенным антиоксидантами рационом кормления животных в данной эколого-географической зоне.
Так как в антиокислительной защите важную роль играет тиол-дисульфидная система, то для выяснения роли этой системы в окислительной модификации белков молока определяли содержание доступных сульфгидрильных групп в различных фракциях молока вышеуказанных зон. Значимых различий в содержании доступных тиоловых групп молока-сырья в различных эколого-географических зонах Омской области не выявлено (рис. 1).
Однако уровень доступных сульфгидрильных групп сыворотки молока хозяйств лесостепной зоны (пригород) ниже на13 % (Р = 0,023) и 26 % (Р = 0,002) относительно степной и лесной зоны соответственно (рис. 2).
Рис. 2. Содержание доступных сульфгидрильных групп в сыворотке в разных природно-климатических зонах Омской области (мкмоль/г)
Рис. 3. Содержание доступных свободных сульфгидрильных групп в разных природно-климатических зонах Омской области (мкмоль/г)
Выявлено достоверное снижение свободных доступных тиоловых групп и в безбелковом надосадке молока хозяйств пригорода Омска на 21 % (Р = 0,006) относительно лесной зоны (рис. 3).
Заключение
Результаты исследования свидетельствуют о более интенсивном процессе свободнорадикального окисления белков молока пригорода промышленного центра по отношению к лесной и степной зонам области. Данное заключение основывается на повышении уровня продуктов спонтанной и металлкатализированной окислительной модификации белков молока данной зоны. Повышенный уровень карбонильных производных белков может быть обусловлен снижением доступных сульфгидрильных групп в сыворотке молока пригорода по отношению к молоку отдалённых от промышленного центра зон области.
Рецензенты:Мкртчан О.З., д.б.н., профессор кафедры биологии, ФГБОУ ВПО «Омский государственный педагогический университет» Минобрнауки РФ, г. Омск;
Степанова И.П., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой химии, ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, г. Омск.
Работа поступила в редакцию 16.12.2014.