Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Поиск новых источников биологически активных соединений с целью получения эффективных и безопасных препаратов является одной из важнейших задач современной биотехнологии. Известно, что высшие базидиомицеты содержат обширный спектр различных биологически активных соединений, таких как полисахариды, белки, фенольные соединения, тритерпены, меланины, каротиноиды, обладающих различными биологическими активностями. Сложность и многообразие химического состава базидиомицетов обуславливает их широкий спектр действия на организм. Получение эффективных и продуктивных штаммов в чистой культуре дает возможность использовать достижения в области биотехнологии для получения биомассы мицелия гриба в промышленных условиях. Выделение биологически активных соединений из культивируемого мицелия гриба имеет преимущество, т.к. качество сырья и выход биологически активных веществ становится контролируемым. Биотехнологические приемы, такие как оптимизация состава питательной среды, условий культивирования, фазы окончания культивирования и т.д., позволяют получать набор БАВ в заданном соотношении.

Ксилотрофный базидиомицет Daedaleopsis tricolor (дедалеопсис трехцветный) является сравнительно малоизученным объектом. Все же известно, что тритерпены, выделенные из этого гриба, обладают антибактериальной и антиоксидантной активностью [10]. При этом водный экстракт из плодового тела Daedaleopsis tricolor проявляют противоопухолевую активность [9].

В связи с этим исследование данного базидиального гриба из местообитаний Западной Сибири, а также полученных из него экстрактов является актуальной задачей.

Целью работы было выделение в чистую культуру гриба Daedaleopsis tricolor, получение экстрактов из плодового тела и мицелиальной массы гриба, исследование содержания основных групп БАВ и биологической активности полученных экстрактов.

Материалы и методы исследования

В работе использовали высушенные плодовые тела грибов, собранные в лесах близ села Вьюны в Колыванском районе Новосибирской обл. с погибшей березы Betula pendula, а также в окрестностях р.п. Кольцово в Новосибирском районе с березы Betula pendula и ивы Salix alba, а также биомассу мицелия, полученную в культуре на основе штаммов Daedaleopsis tricolor, выделенных нами из плодовых тел.

Выделение в культуру гриба проводилось преимущественно из тканей плодового тела. Кусочки плодового тела помещали на агаризованную питательную среду в чашки Петри. Через 6–8 суток на питательной среде наблюдался молодой растущий мицелий. Далее культуру очищали от микромицетов с помощью серии пересевов на чашки с агаризованной средой. Использовали две питательные среды: овсяной отвар агаризованный и обогащенную среду на основе мелассы и кукурузного экстракта [3].

Для суспензионного и поверхностного культивирования использовали глюкозо-пептонную среду (ГПС) следующего состава (г/л): глюкоза – 30,0 г; пептон – 5,0 г; дрожжевой экстракт – 2,0 г; KH2PO4 – 1,0 г; MgSO4 – 0,5 г. [3]. Процесс глубинного культивирования проводили в колбах вместимостью 500 мл в 100 мл ГПС на круговых качалках при скорости вращения 190 об/мин, температуре (26 ± 2) °С в течение 5–7 суток, используя в качестве посевного материала 2–3-х суточный инокулят глубинной культуры, выращенный на той же среде, в количестве 20 % по объёму. Поверхностное культивирование на жидкой питательной среде проводили при комнатной температуре в таких же стеклянных флаконах, находящихся в горизонтальном положении, в течение 27 суток в темном месте и 6 суток – при рассеянном свете (общее время культивирования – 33 суток). Полученную методами поверхностного и глубинного культивирования биомассу отделяли, отмывали от культуральной жидкости дистиллированной водой, высушивали при температуре 60 °С и измельчали в фарфоровой ступке.

Из сухого измельченного плодового тела и сухой биомассы культивированного гриба получали водные и этанольные экстракты. Для получения сухих этанольных экстрактов использовали метод четырехкратной дробной мацерации 70 %-ым этанолом при температуре 60 °С и соотношении сырья к экстрагенту 1:50, при общем времени экстракции 4 часа. При получении сухих водных экстрактов сырье с водой нагревали при 95–100 °С в колбе с обратным холодильником в течение 1 часа, отделяли экстракт, и процедуру повторяли. Соотношение сырья к экстрагенту составило 1:50. Охлажденные экстракты фильтровали, упаривали и высушивали при температуре 60 °С.

Качественный анализ каротиноидов, флавоноидов и тритерпенов проводили методом ТСХ. Содержание белка в образцах определяли методом Бредфорд, полисахариды анализировали методом Дрейвуда в модификации [5]. Количественное содержание фенольных соединений в экстрактах определяли по окислительно-восстановительной реакции Фолина-Чикольте [6]. Содержание каротиноидов анализировали методом спектрофотометрии в пересчете на β-каротин [4].

Восстанавливающую способность экстрактов оценивали по методу FRAP [7]. Антиоксидантная активность экстрактов была исследована в реакции окисления Твин-80 кислородом воздуха [6]. Исследуя антиоксидантную, в том числе железо-восстанавливающую, активность экстрактов использовали положительные контроли (образцы сравнения), а именно препараты, обладающие антиоксидантной активностью: кислота галловая, арбутин, кислота аскорбиновая, дигидрокверцетин.

Анализ противоопухолевой активности полученных экстрактов проводили методом подсчета клеток в камере Горяева, используя культуру клеток Hep-2 (карцинома гортани человека). В качестве контроля использовали перевиваемые линии клеток MDCK и Vero.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с помощью пакета компьютерных программ анализа данных Microsoft Excel.

Результаты исследования и их обсуждение

Выделены в чистую культуру три штамма базидиального гриба Daedaleopsis tricolor из плодовых тел, собранных с разных субстратов и с разных мест произрастания Новосибирской обл. Штамм Db-14 выделен из плодовых тел, собранных близ села Вьюны в Колыванском районе, штамм Db-18 – из плодовых тел, в окрестностях р.п. Кольцово в Новосибирском районе с березы Betula pendula, штамм Dr-17 – из плодовых тел, в окрестностях р.п. Кольцово с ивы Salix alba.

Исследуя культурально-морфологические особенности штаммов Daedaleopsis tricolor, выявлено, что в культуре они образуют плотные колонии сначала белого, а на 14–16 сутки роста – песочного или коричневого цвета. При микроскопическом исследовании (увеличение 400, 1000) наблюдается слабо разветвленный, септированный, мицелий с многочисленными пряжками одиночного типа, генеративные гифы бесцветные.

На основе выделенных штаммов методами глубинного и поверхностного культивирования на глюкозо-пептонной среде получена биомасса мицелия гриба Daedaleopsis tricolor. Содержание сухой биомассы мицелия гриба, выращенного глубинным способом в течение 7 суток, составляло от 5,1 до 7,4 г/л, в то время как для получения от 5,6 до 7,7 г/л сухой биомассы мицелия методом поверхностного культивирования потребовалось 33 суток.

Сухие экстракты из плодовых тел и культивируемого мицелия гриба Daedaleopsis tricolor охарактеризованы по физико-химическим параметрам. Все экстракты показали наличие полисахаридов, белка и фенольных соединений. Каротиноды и тритерпены обнаружены в этанольных экстрактах, как из плодовых тел гриба, так и из мицелия, в то время как в водных экстрактах эти группы БАВ обнаружены не были. Показано, что выход экстрактивных веществ из мицелия в 3–5 раз выше, чем из плодового тела, при этом содержание некоторых групп БАВ в экстрактах из плодовых тел гриба, в 2–4 раза выше, чем в экстрактах из мицелия. Содержание полисахаридов в водных экстрактах гриба несколько выше, чем в этанольных, в то же время содержание фенольных соединений и флавоноидов в этанольных экстрактах гриба в целом выше, чем в водных экстрактах (табл. 1, 2).

Таблица 1

Физико-химические характеристики экстрактов из плодовых тел Daedaleopsis tricolor в зависимости от субстрата, на котором росли грибы

Примечание: М – среднее арифметическое; m – ошибка среднего; n – число опытов; критерий Стьюдента при р ≤ 0,05.

Таблица 2

Физико-химические характеристики экстрактов из мицелия Daedaleopsis tricolor

Примечание: М – среднее арифметическое; m – ошибка среднего; n – число опытов; критерий Стьюдента при р ≤ 0,05.

Известно, что избыточное образование в организме активных форм кислорода влечет за собой нежелательные реакции, лежащие в основе целого ряда заболеваний. Ранее было показано, что некоторые высшие базидиомицеты проявляют антиоксидантные свойства [2]. Нами установлено, что наибольшую антиоксидантную активность в реакции окисления Твин-80 проявили экстракты из культивируемого мицелия Daedaleopsis tricolor. В то же время все экстракты гриба проявили низкую железо-восстанавливающую способность (табл. 3).

Таблица 3

Антиоксидантная активность экстрактов Daedaleopsis tricolor

Примечание: АОА – антиоксидантная активность в реакции окисления Твин-80 кислородом воздуха; ВС – восстанавливающая способность (приравнивается к тангенсу угла наклона); (К+) – положительный контроль; М – среднее арифметическое; m – ошибка среднего; n – число опытов; критерий Стьюдента при р ≤ 0,05.

В связи с тем, что наличие антиоксидантной активности препаратов может свидетельствовать о наличии противоопухолевых свойств, экстракты исследовали на цитотоксическую активность методом подсчета клеток. Для анализа противоопухолевой активности использовали клеточную линию Hep-2. Рассчитывали индексы пролиферации, оценивали рост клеток в зависимости от концентрации сухого вещества, определяли концентрацию, ингибирующую рост клеток на 50 % (IC50) для водных экстрактов, полученных из плодовых тел и мицелия гриба. Было выявлено, что IC50 водного экстракта из плодового тела гриба находилась в пределах 200–300 мкг/мл, а IC50 экстракта из мицелия – 100–115 мкг/мл. Таким образом, водный экстракт мицелия проявил более высокую антипролиферативную активность в отношении клеточной линии Hep-2, чем экстракт из плодового тела гриба. В связи с этим водный экстракт мицелия Daedaleopsis tricolor является перспективным агентом для разработки и получения противоопухолевого препарата. Исследуя токсичность на нормальных клетках, выявлено, что экстракты в концентрациях до 2000 мкг/мл не оказывали токсического действия на клетки MDCK и Vero.

Результаты исследования биологической активности гриба Daedaleopsis tricolor свидетельствуют, что экстракты, полученные из выращенного в культуре мицелия гриба, показывают, как правило, более высокую биологическую активность в сравнении с экстрактами из плодовых тел данного базидиомицета.

Выводы

В чистую культуру выделено 3 штамма гриба Daedaleopsis tricolor из плодовых тел, собранных с разных субстратов. Экстракты, полученные из плодовых тел и сухой биомассы мицелия Daedaleopsis tricolor, охарактеризованы по основным группам биологически активных веществ. Выявлена антиоксидантная активность экстрактов из гриба Daedaleopsis tricolor. Показана антипролиферативная активность экстрактов Daedaleopsis tricolor. Проведено сравнение экстрактов, полученных из плодовых тел и культивируемого мицелия по биохимическому составу и биологической активности. Выявлено, что экстракты, полученные из культивируемого мицелия гриба, в большинстве случаев показывают более высокую биологическую активность, чем экстракты, выделенные из плодовых тел. Проявление экстрактами биологической активности открывает перспективу использования гриба Daedaleopsis tricolor для разработки и получения лекарственных препаратов.

Мазуркова Н.А., д.б.н., заведующая лабораторией препаратов природного происхождения, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово;

Белявская В.А., д.б.н., профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово.

Работа поступила в редакцию 05.12.2014.