Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

COMPARATIVE ANALYSIS OF THE FREQUENCY DISTRIBUTION OF ALLELES AND GENOTYPES POLYMORPHISMS RS 231775 AND RS 3087243 GENE CTLA-4 IN PATIENTS WITH DIABETES MELLITUS TYPE 1 AND TYPE 1 DIABETES COMBINED WITH AUTOIMMUNE THYROIDITIS

Repina E.A. 1 Boldyreva M.N. 2 Suntsov Y.I. 1 Bateneva E.I. 3 Kadochnikova V.V. 3 Ilin A.V. 1 Troshina E.A. 1
1 FGBU «Endocrinology Research Centre» The Ministry of Health
2 FGBU «Institute of Immunology» FMBA of Russia
3 ZAO «DNA Technology»
Проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у 83 пациентов с сахарным диабетом 1 типа (СД1) и 91 пациента с сочетанием СД1 с аутоиммунным тиреоидитом (АИТ). Контрольную группу составили 108 доноров крови без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним. Установлены достоверное увеличение частоты аллеля G (р = 0,005) и генотипа GG (p = 0,0116) полиморфизма rs 231775 в группе пациентов с СД1 по сравнению с контролем. Также установлено достоверное увеличение частоты аллеля G (p = 0,0016) данного полиморфизма в группе пациентов с СД1 в сочетании с АИТ по сравнению с пациентами с изолированным СД1, по результатам тренд-теста установлены статистически значимые различия в частоте генотипов между данными группами (p = 0,002). Достоверных отличий между аллелями и генотипами SNP rs 3087243 гена CTLA-4 во всех исследуемых группах выявлено не было. Увеличение частоты аллеля G (p = 0,005) и генотипа GG (p = 0,0116) в группе пациентов с изолированным СД1 по сравнению с контролем свидетельствует об ассоциации данного варианта полиморфного маркера rs 231775 гена CTLA-4 с повышенным риском развития СД1, что совпадает с данными других исследователей.
A comparative analysis of the distribution of allele and genotype frequencies of polymorphisms rs 231775 and rs 3087243 CTLA-4 gene in 83 patients with type 1 diabetes mellitus (T1DM) and 91 patients with a combination of type 1 diabetes with autoimmune thyroiditis (AIT). The control group consisted of 108 blood donors without autoimmune diseases, and family history on them. A significant increase in the frequency of allele G (p = 0,005) and genotype GG (p = 0,0116) polymorphism rs 231775 in patients with type 1 diabetes compared to the control. Also found a significant increase in the frequency of allele G (p = 0,0016) of polymorphism in patients with type 1 diabetes in combination with AIT compared to patients with isolated T1D, the results of the trend test set of statistically significant differences in genotype frequencies between the groups (p = 0,002). Significant differences between the allele and genotype SNP rs 3087243 CTLA-4 gene in all groups have been identified. Increasing the frequency of allele G (p = 0,005) and genotype GG (p = 0,0116) in the group of patients with isolated DM1 compared to the control indicates the association of this embodiment, the polymorphic marker gene rs 231775 CTLA-4 with an increased risk of developing type 1 diabetes, coinciding with the data of other researchers.
diabetes Mellitus type 1
autoimmune thyroiditis
CTLA-4 gene
allelic variants
polymorphism
1. Abramov D.D., Dedov I.I., Trofimov D.Y., Boldyre- va M.N., Kuraeva T.L., Alekseev L.P. Polymorphism of CTLA-4 (49А/G) in the Russian population of the patients with type 1 diabetes and healthy donors // Diabetes. 2007. Vol. 3. рр. 5–8.
2. Alekseev L.P., Dedov I.I., Khaitov R.M., Bol- dyreva M.N., Shestakova M.V., Peterkova V.A., Kuraeva T.L., Prokofiev S.A. Clinical significance of determination of HLA-DRB1-genotypes associated with susceptibility or resistance to type 1 diabetes in different ethnic groups in Russia // Diabetes. 2007. Vol. 3. рр. 2–5.
3. Brovkina O.I. Investigation of association of candidate genes with type 1 diabetes and diagnostic test systems for the early detection of risk development of type 1 diabetes: Author. Dis. cand. med. sciences. Moscow, 2012. 22 p.
4. Dedov I.I., Shestakova M.V. Diabetes: Hands-on for physicians. M.: Universum Publishing, 2003. рр. 77–81.
5. Repina E.A. Common genetic markers of type 1 diabetes and autoimmune thyroid diseases // Diabetes. 2011. Vol. 2. рр. 23–30.
6. Dittmar M., Kahaly G.J. Polyglandular autoimmune syndromes: immunogenetics and long-term follow-up. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. Vol. 88. рр. 2983–2992.
7. Eisenbarth G.S., Gottlieb P.A. Autoimmune polyendocrine syndromes // N. Engl. J. Med. 2004. Vol. 350. рр. 2068–2079.
8. Encinas J.A., Kuchroo V.K. Mapping and identification of autoimmunity genes // Curr. Opin. Immunol. 2000. Vol. 12. рр. 691–697.
9. Huber A., Menconi F., Corathers S., Jacobson E.M., Tomer Y. Joint genetic susceptibility to type 1 diabetes and autoimmune thyroiditis: from epidemiology to mechanisms // Endocr. Rev. 2008. Vol. 29. рр. 697–725.
10. Levin L., Tomer Y. The etiology of autoimmune diabetes and thyroiditis: evidence for common genetic susceptibility // Autoimmun. Rev. 2003. Vol. 2. рр. 377–386.
11. Sougioultzoglou F., Falorni A., Kassi G., Brozzetti A., Karamitsos D., Koliakos G.G. Coincidence of high antiislet and antithyroid autoantibody titles in first-degree relatives of patients with type 1 diabetes // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2005. Vol. 113. рр. 85–89.

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – полигенное многофакторное заболевание, развитие которого связано с аутоиммунной деструкцией β-клеток поджелудочной железы.

Генетическая предрасположенность играет определяющую роль в механизмах манифестации и прогрессирования аутоиммунного воспаления при СД1 [2, 4].

К настоящему времени выявлено 18 локусов, находящихся на разных хромосомах, которые в той или иной степени предрасполагают к СД1. Некоторые из них ассоциированы не только с СД1, но и с другими аутоиммунными заболеваниями (АИЗ), такими как АИЗ щитовидной железы, болезнь Аддисона, целиакия, системная красная волчанка, ревматоидный артрит [8].

На одном из таких локусов находится ген CTLA-4, который занимает около 6,2 kb на второй хромосоме (2q33), состоит из 4 экзонов. Его белковый продукт экспрессируется Т-лимфоцитами на поздних стадиях активации и ингибирует их пролиферацию.

В многочисленных работах, посвященных патогенетической роли гена CTLA-4, была обнаружена ассоциация ряда однонуклеотидных полиморфизмов данного гена с развитием СД1 [6], диффузного токсического зоба (ДТЗ) [9] и аутоиммунного тиреоидита (АИТ) [10].

Из всех вариантов сочетаний АИЗ наиболее частой является ассоциация СД1 с АИТ. Распространенность АИТ у родственников больных СД1 достигает 48 % по сравнению с общей популяцией – лишь 3–10 % [11]. До 50 % больных СД1 имеют положительные антитела к ткани щитовидной железы (АтЩЖ), из них примерно у 50 % отмечались клинические проявления АИТ [9]. С другой стороны, 2,3 % детей с АИТ имели антитела к островковым клеткам поджелудочной железы (ICA) по сравнению с 0 % в контроле [7].

Трудности в изучении особенностей иммуногенетики СД1 всегда были сопряжены с клинической гетерогенностью данного заболевания. Многочисленные исследования показали сильное влияние наряду с генами HLA II класса, гена CTLA-4 на совместную предрасположенность к СД1 и АИТ в семьях и у одного и того же человека [5].

Наиболее часто в литературе упоминаются два полиморфизма гена CTLA-4 – rs 231775 (49 A/G) и rs 3087243 (CT60 A/G). Первый из них – более исследованный полиморфизм, расположенный в первом экзоне гена CTLA-4, характеризуется заменой треонина на аланин в 17 кодоне лидерного пептида и ассоциирован со многими заболеваниями [1, 3].

Полиморфный маркер rs3087243, расположенный в промоторной области гена CTLA-4, был исследован ранее в основном в связи с риском развития аутоиммунных заболеваний, кодирует антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов и отвечает за уровень активации Т-клеток [3].

Задачей настоящего исследования является сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов двух полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и пациентов, имеющих сочетание СД1 с АИТ.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 174 пациента с СД1, которые находились на обследовании и лечении в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ. Все пациенты были разделены на 2 группы: в первую группу вошел 91 пациент с СД1 и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ), вторую группу составили 83 пациента с СД1 и отрицательными титрами АтЩЖ. При исследовании полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 были сформированы следующие группы:

1) СД1 + серонегативные по АтЩЖ (n = 70), средний возраст пациентов 27,89 ± 12,16 лет, из них мужчин – 40 (57 %), женщин – 30 (43 %);

2) СД1 + АИТ (n = 60), средний возраст пациентов 36,05 ± 12,39 лет, из них мужчин – 10 (17 %), женщин – 50 (83 %).

При исследовании полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 – группы:

1) СД1 + серонегативные по АтЩЖ (n = 65), средний возраст пациентов 27,34 ± 12,24 лет, из них мужчин – 37 (65 %), женщин – 28 (35 %);

2) СД1 + АИТ (n = 28), средний возраст пациентов 36,68 ± 13,24 лет, из них мужчин – 2 (7 %), женщин – 26 (93 %).

Контрольную группу составили 108 человек из московской популяции без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним, средний возраст в контрольной группе (n = 108) – 46,3 ± 9,3 лет, мужчин 73 (68 %), женщин – 35 (32 %). У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

Типирование однонуклеотидных полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флюоресцентными метками и автоматической регистрацией результатов реакции в режиме реального времени (real-time PCR) наборами компании «ДНК-Технология» (Москва) на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология») в соответствии с инструкциями производителя.

Количественное определение титров аутоантител к тиреоглобулину (ATG) и тиреопероксидазе (ATPO) в сыворотках крови осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Biomerica» (лаборатория клинической биохимии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ, зав. – А.В. Ильин).

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных подходов, используемых при проведении популяционно-генетических исследований.

Аллельные варианты полиморфных генов подвергались классическому молекулярно-эпидемиологическому анализу – сопоставлению встречаемости аллелей и генотипов у больных СД1, СД1 + АИТ и контролей. Тест на соответствие контрольной выборки равновесию Харди – Вайнберга проводили с использованием метода χ2 (α = 0,05, df = 1). Для выявления ассоциации между заболеванием и генотипом использовались мультипликативная и аддитивная модели наследования.

Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью критерия χ2 (c коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), либо точным двусторонним критерием Фишера, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей. Статистика: аллель предрасположенности (риска) А против второго аллеля (протекторного) В. Анализ тенденций (trend test) проводили с использованием аддитивной модели наследования (тест Кохрана – Армитажа для линейных трендов с одной степенью свободы). Достоверными считали различия при уровне ошибки р ≤ 0,05/3 = 0,016, то есть допускали 1,6 % вероятность того, что найденная в выборке связь между переменными является лишь случайной особенностью данной выборки. Уменьшение уровня значимости связано с наличием множественных сравнений и, как следствие, введением поправки Бонферрони.

Показатели «отношения шансов» (OR-odds ratio) с 95 % доверительным интервалом (95 % CI) рассчитывались для «редкого» аллеля, носителей «редкого» аллеля (гетерозигот + гомозигот по «редкому» аллелю) относительно «частых» аллелей и гомозигот по «частому» аллелю соответственно. Аналогичный расчет проводился для гомозигот по «редкому» аллелю относительно гетерозигот и гомозигот по «частому» аллелю.

Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводилось с использованием критерия Краскела – Уоллиса и точного двустороннего критерия Фишера.

Отношение рисков (RR-related risk) рассчитано как отношение риска наступления события (СД1) у лиц, имеющих фактор риска (определенное сочетание генотипов) по отношению к контрольной группе.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами впервые проведено сравнительное исследование SNP rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и СД1 в сочетании с АИТ.

Исследование частоты встречаемости однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775), расположенной в первом экзоне гена CTLA4

Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 1. Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованному локусу гена CTLA-4 в контрольной выборке соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди – Вайнберга (p = 0,78).

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля G среди больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 81/140 (58 %), в сравнении со здоровыми лицами 91/216 (42 %) (OR = 1,89, 95 % CI: 1,23–2,90, р = 0,005) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и в контрольной группе

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

Частота аллелей, абс./отн.

AA

AG

GG

Всего

A

G

Всего

СД1 без АтЩЖ

13/0,19

33/0,48

24/0,34

70/1

59/0,421

81/0,579

140/1

Контроль

35/0,32

55/0,51

18/0,17

108/1

125/0,579

91/0,421

216/1

Частота носителей «редкого» аллеля G у больных СД1, серонегативных по АтЩЖ (лица с генотипами АG и GG), была незначимо выше – 57/70 (81 %), чем в группе контроля – 73/108 (68 %) (относительно лиц с генотипом АА – OR = 2,1, 95 % CI: 1,02–4,34, p = 0,063). При этом частота генотипа GG достоверно выше в группе пациентов (34 %) по сравнению с группой контроля (17 %), p = 0,0116, OR = 2,1, 95 % CI: 1,21–3,5. Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом CTLA-4 rs 231775 и предрасположенностью к развитию СД1, серонегативного по АтЩЖ, в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана – Армитажа) показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (p = 0,004), что свидетельствует о наличии тенденции к повышению степени ассоциации генотипа с риском развития изолированной формы СД1 при увеличении в генотипе количества аллелей G. Вывод о том, что носители аллеля G и генотипа GG имеют повышенный риск развития СД1, согласуется с данными ряда исследователей [1, 3].

Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, сочетанным с аутоиммунным тиреоидитом, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 2.

Таблица 2

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, сочетанным с АИТ, и в контрольной группе

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

Частота аллелей, абс./отн.

AA

AG

GG

Всего

A

G

Всего

СД1 + АИТ

27/0,45

21/0,35

12/0,2

60/1

75/0,625

45/0,375

120/1

Контроль

35/0,32

55/0,51

18/0,17

108/1

125/0,579

91/0,421

216/1

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 среди больных СД1 с АИТ и доноров не выявил статистически значимых различий (p = 0,48 для «редких» аллелей, p = 0,15 для носителей «редкого» аллеля и p = 0,68 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю).

Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с изолированным СД1 и СД1, сочетанным с АИТ, представлены в табл. 3.

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля G среди больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 81/140 (58 %), в сравнении с пациентами, страдающими СД1 в сочетании с АИТ, – 45/120 (37,5 %) (OR = 2,29, 95 % CI: 1,39–3,77, р = 0,0016) (табл. 3).

Таблица 3

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и СД1 в сочетании с АИТ

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

Частота аллелей, абс./отн.

AA

AG

GG

Всего

A

G

Всего

СД1 без АтЩЖ

13/0,19

33/0,48

24/0,34

70/1

59/0,421

81/0,579

140/1

СД1 в сочетании с АИТ

27/0,45

21/0,35

12/0,2

60/1

75/0,625

45/0,375

120/1

Частота носителей «редкого» аллеля G у больных СД1, серонегативных по АтЩЖ (лица с генотипами АG и GG), была достоверно выше – 57/70 (81 %), чем в группе СД1 + АИТ – 33/60 (55 %), OR = 3,59, 95 % CI: 1,63–7,89, p = 0,0022. При этом частота генотипа GG недостоверно выше в группе пациентов (34 %) по сравнению с группой контроля (20 %), p = 0,11, OR = 1,7, 95 % CI: 0,94–3,13. Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом CTLA-4 rs 231775 и определенной клинической формой СД1, в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана – Армитажа) показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (p = 0,002), что свидетельствует о наличии тенденции к высокой степени ассоциации генотипа данного полиморфизма с клинической формой сахарного диабета.

Исследование частоты встречаемости однонуклеотидной замены CT60 A/G (rs 3087243), расположенной в промоторной области гена CTLA4

Результаты исследования частот аллельных вариантов и генотипов полиморфизма CT60 A/G (rs 3087243) гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, сочетанным с аутоиммунным тиреоидитом, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 4. Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованному локусу гена CTLA-4 в контроле соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди – Вайнберга (p = 0,67).

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 среди больных СД1 с АИТ доноров не выявил статистически значимых различий (p = 1 для «редких» аллелей, p = 1 для носителей «редкого» аллеля и p = 1 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю).

Таблица 4

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, сочетанным с АИТ, и в контрольной группе

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

Частота аллелей, абс./отн.

AA

AG

GG

Всего

A

G

Всего

СД1 + АИТ

5/0,18

12/0,43

11/0,39

28/1

22/0,39

34/0,61

56/1

Контроль

18/0,17

48/0,44

42/0,39

108/1

84/0,39

132/0,61

216/1

Результаты исследования частот аллельных вариантов и генотипов полиморфизма CT60 A/G (rs 3087243) гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 5.

Аллель G полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 – более частое явление для пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ (73 %), по сравнению с группой контроля (61 %), OR = 1,73, 95 % CI: 1,07–2,78. Однако анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 среди больных СД1 без АтЩЖ доноров выявил следующие различия, близкие к достоверным: p = 0,0314 для «редкого» аллеля, p = 0,0507 для гомозигот по «редкому» аллелю (OR = 1,42, 95 % CI: 1,00–1,97). Согласно данным других исследователей, маркер rs 3087243 гена CTLA-4 высоко достоверно ассоциирован с СД1 [22]. В связи с этим полученные нами данные, по-видимому, обусловлены малой выборкой исследуемых групп.

Таблица 5

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и в контрольной группе

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

Частота аллелей, абс./отн.

AA

AG

GG

Всего

A

G

Всего

СД1 без АтЩЖ

6/0,09

23/0,35

36/0,56

65/1

35/0,27

95/0,73

130/1

Контроль

18/0,17

48/0,44

42/0,39

108/1

84/0,39

132/0,61

216/1

Результаты исследования частот аллельных вариантов и генотипов полиморфизма CT60 A/G (rs 3087243) гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и пациентов с СД1, сочетанным с АИТ, представлены в табл. 6. Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 не выявил статистически значимых различий.

Таблица 6

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и у пациентов с СД1, сочетанным с АИТ

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

Частота аллелей, абс./отн.

AA

AG

GG

Всего

A

G

Всего

СД1 без АтЩЖ

6/0,09

23/0,35

36/0,56

65/1

35/0,27

95/0,73

130/1

СД1 + АИТ

5/0,18

12/0,43

11/0,39

28/1

22/0,39

34/0,61

56/1

В настоящее время не решен вопрос о взаимном влиянии отдельных локусов гена CTLA-4 и вкладе их белковых продуктов в формирование аутоиммунного воспаления. Поэтому исследования в этом направлении необходимо продолжить.

Выводы

Таким образом, полученные нами данные подтверждают результаты других исследователей о том, что СД1 ассоциирован с G(GG) в rs231775 гена CTLA-4.

При этом мы не получили доказанную ассоциацию данного полиморфизма с СД1 в сочетании с АИТ.

Пациенты с сочетанием СД1 с АИТ по распределению rs231775 ближе к норме по сравнению с изолированным СД1.

Для полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 нами не выявлено достоверной ассоциации ни с одной из исследованных групп, что скорее всего связано с их малочисленностью.

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов, связанных с рукописью.

Источник финансирования – работа выполнена на средства, выделенные для Федеральной целевой программы «Сахарный диабет».

Рецензенты:

Алексеев Л.П., д.м.н., профессор, зам. директора, заведующий отделом иммуногенетики, ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА, г. Москва;

Кондраченко М.Ю., д.м.н., профессор, ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» МЗ РФ, г. Пенза.

Работа поступила в редакцию 28.11.2014.