Сахарный диабет 1 типа (СД1) – полигенное многофакторное заболевание, развитие которого связано с аутоиммунной деструкцией β-клеток поджелудочной железы.

Генетическая предрасположенность играет определяющую роль в механизмах манифестации и прогрессирования аутоиммунного воспаления при СД1 [2, 4].

К настоящему времени выявлено 18 локусов, находящихся на разных хромосомах, которые в той или иной степени предрасполагают к СД1. Некоторые из них ассоциированы не только с СД1, но и с другими аутоиммунными заболеваниями (АИЗ), такими как АИЗ щитовидной железы, болезнь Аддисона, целиакия, системная красная волчанка, ревматоидный артрит [8].

На одном из таких локусов находится ген CTLA-4, который занимает около 6,2 kb на второй хромосоме (2q33), состоит из 4 экзонов. Его белковый продукт экспрессируется Т-лимфоцитами на поздних стадиях активации и ингибирует их пролиферацию.

В многочисленных работах, посвященных патогенетической роли гена CTLA-4, была обнаружена ассоциация ряда однонуклеотидных полиморфизмов данного гена с развитием СД1 [6], диффузного токсического зоба (ДТЗ) [9] и аутоиммунного тиреоидита (АИТ) [10].

Из всех вариантов сочетаний АИЗ наиболее частой является ассоциация СД1 с АИТ. Распространенность АИТ у родственников больных СД1 достигает 48 % по сравнению с общей популяцией – лишь 3–10 % [11]. До 50 % больных СД1 имеют положительные антитела к ткани щитовидной железы (АтЩЖ), из них примерно у 50 % отмечались клинические проявления АИТ [9]. С другой стороны, 2,3 % детей с АИТ имели антитела к островковым клеткам поджелудочной железы (ICA) по сравнению с 0 % в контроле [7].

Трудности в изучении особенностей иммуногенетики СД1 всегда были сопряжены с клинической гетерогенностью данного заболевания. Многочисленные исследования показали сильное влияние наряду с генами HLA II класса, гена CTLA-4 на совместную предрасположенность к СД1 и АИТ в семьях и у одного и того же человека [5].

Наиболее часто в литературе упоминаются два полиморфизма гена CTLA-4 – rs 231775 (49 A/G) и rs 3087243 (CT60 A/G). Первый из них – более исследованный полиморфизм, расположенный в первом экзоне гена CTLA-4, характеризуется заменой треонина на аланин в 17 кодоне лидерного пептида и ассоциирован со многими заболеваниями [1, 3].

Полиморфный маркер rs3087243, расположенный в промоторной области гена CTLA-4, был исследован ранее в основном в связи с риском развития аутоиммунных заболеваний, кодирует антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов и отвечает за уровень активации Т-клеток [3].

Задачей настоящего исследования является сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов двух полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и пациентов, имеющих сочетание СД1 с АИТ.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 174 пациента с СД1, которые находились на обследовании и лечении в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ. Все пациенты были разделены на 2 группы: в первую группу вошел 91 пациент с СД1 и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ), вторую группу составили 83 пациента с СД1 и отрицательными титрами АтЩЖ. При исследовании полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 были сформированы следующие группы:

1) СД1 + серонегативные по АтЩЖ (n = 70), средний возраст пациентов 27,89 ± 12,16 лет, из них мужчин – 40 (57 %), женщин – 30 (43 %);

2) СД1 + АИТ (n = 60), средний возраст пациентов 36,05 ± 12,39 лет, из них мужчин – 10 (17 %), женщин – 50 (83 %).

При исследовании полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 – группы:

1) СД1 + серонегативные по АтЩЖ (n = 65), средний возраст пациентов 27,34 ± 12,24 лет, из них мужчин – 37 (65 %), женщин – 28 (35 %);

2) СД1 + АИТ (n = 28), средний возраст пациентов 36,68 ± 13,24 лет, из них мужчин – 2 (7 %), женщин – 26 (93 %).

Контрольную группу составили 108 человек из московской популяции без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним, средний возраст в контрольной группе (n = 108) – 46,3 ± 9,3 лет, мужчин 73 (68 %), женщин – 35 (32 %). У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

Типирование однонуклеотидных полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флюоресцентными метками и автоматической регистрацией результатов реакции в режиме реального времени (real-time PCR) наборами компании «ДНК-Технология» (Москва) на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология») в соответствии с инструкциями производителя.

Количественное определение титров аутоантител к тиреоглобулину (ATG) и тиреопероксидазе (ATPO) в сыворотках крови осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Biomerica» (лаборатория клинической биохимии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ, зав. – А.В. Ильин).

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных подходов, используемых при проведении популяционно-генетических исследований.

Аллельные варианты полиморфных генов подвергались классическому молекулярно-эпидемиологическому анализу – сопоставлению встречаемости аллелей и генотипов у больных СД1, СД1 + АИТ и контролей. Тест на соответствие контрольной выборки равновесию Харди – Вайнберга проводили с использованием метода χ2 (α = 0,05, df = 1). Для выявления ассоциации между заболеванием и генотипом использовались мультипликативная и аддитивная модели наследования.

Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью критерия χ2 (c коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), либо точным двусторонним критерием Фишера, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей. Статистика: аллель предрасположенности (риска) А против второго аллеля (протекторного) В. Анализ тенденций (trend test) проводили с использованием аддитивной модели наследования (тест Кохрана – Армитажа для линейных трендов с одной степенью свободы). Достоверными считали различия при уровне ошибки р ≤ 0,05/3 = 0,016, то есть допускали 1,6 % вероятность того, что найденная в выборке связь между переменными является лишь случайной особенностью данной выборки. Уменьшение уровня значимости связано с наличием множественных сравнений и, как следствие, введением поправки Бонферрони.

Показатели «отношения шансов» (OR-odds ratio) с 95 % доверительным интервалом (95 % CI) рассчитывались для «редкого» аллеля, носителей «редкого» аллеля (гетерозигот + гомозигот по «редкому» аллелю) относительно «частых» аллелей и гомозигот по «частому» аллелю соответственно. Аналогичный расчет проводился для гомозигот по «редкому» аллелю относительно гетерозигот и гомозигот по «частому» аллелю.

Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводилось с использованием критерия Краскела – Уоллиса и точного двустороннего критерия Фишера.

Отношение рисков (RR-related risk) рассчитано как отношение риска наступления события (СД1) у лиц, имеющих фактор риска (определенное сочетание генотипов) по отношению к контрольной группе.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами впервые проведено сравнительное исследование SNP rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и СД1 в сочетании с АИТ.

Исследование частоты встречаемости однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775), расположенной в первом экзоне гена CTLA4

Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 1. Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованному локусу гена CTLA-4 в контрольной выборке соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди – Вайнберга (p = 0,78).

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля G среди больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 81/140 (58 %), в сравнении со здоровыми лицами 91/216 (42 %) (OR = 1,89, 95 % CI: 1,23–2,90, р = 0,005) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и в контрольной группе

Частота носителей «редкого» аллеля G у больных СД1, серонегативных по АтЩЖ (лица с генотипами АG и GG), была незначимо выше – 57/70 (81 %), чем в группе контроля – 73/108 (68 %) (относительно лиц с генотипом АА – OR = 2,1, 95 % CI: 1,02–4,34, p = 0,063). При этом частота генотипа GG достоверно выше в группе пациентов (34 %) по сравнению с группой контроля (17 %), p = 0,0116, OR = 2,1, 95 % CI: 1,21–3,5. Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом CTLA-4 rs 231775 и предрасположенностью к развитию СД1, серонегативного по АтЩЖ, в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана – Армитажа) показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (p = 0,004), что свидетельствует о наличии тенденции к повышению степени ассоциации генотипа с риском развития изолированной формы СД1 при увеличении в генотипе количества аллелей G. Вывод о том, что носители аллеля G и генотипа GG имеют повышенный риск развития СД1, согласуется с данными ряда исследователей [1, 3].

Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, сочетанным с аутоиммунным тиреоидитом, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 2.

Таблица 2

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, сочетанным с АИТ, и в контрольной группе

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 среди больных СД1 с АИТ и доноров не выявил статистически значимых различий (p = 0,48 для «редких» аллелей, p = 0,15 для носителей «редкого» аллеля и p = 0,68 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю).

Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с изолированным СД1 и СД1, сочетанным с АИТ, представлены в табл. 3.

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля G среди больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 81/140 (58 %), в сравнении с пациентами, страдающими СД1 в сочетании с АИТ, – 45/120 (37,5 %) (OR = 2,29, 95 % CI: 1,39–3,77, р = 0,0016) (табл. 3).

Таблица 3

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1 и СД1 в сочетании с АИТ

Частота носителей «редкого» аллеля G у больных СД1, серонегативных по АтЩЖ (лица с генотипами АG и GG), была достоверно выше – 57/70 (81 %), чем в группе СД1 + АИТ – 33/60 (55 %), OR = 3,59, 95 % CI: 1,63–7,89, p = 0,0022. При этом частота генотипа GG недостоверно выше в группе пациентов (34 %) по сравнению с группой контроля (20 %), p = 0,11, OR = 1,7, 95 % CI: 0,94–3,13. Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом CTLA-4 rs 231775 и определенной клинической формой СД1, в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана – Армитажа) показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (p = 0,002), что свидетельствует о наличии тенденции к высокой степени ассоциации генотипа данного полиморфизма с клинической формой сахарного диабета.

Исследование частоты встречаемости однонуклеотидной замены CT60 A/G (rs 3087243), расположенной в промоторной области гена CTLA4

Результаты исследования частот аллельных вариантов и генотипов полиморфизма CT60 A/G (rs 3087243) гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, сочетанным с аутоиммунным тиреоидитом, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 4. Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованному локусу гена CTLA-4 в контроле соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди – Вайнберга (p = 0,67).

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 среди больных СД1 с АИТ доноров не выявил статистически значимых различий (p = 1 для «редких» аллелей, p = 1 для носителей «редкого» аллеля и p = 1 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю).

Таблица 4

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, сочетанным с АИТ, и в контрольной группе

Результаты исследования частот аллельных вариантов и генотипов полиморфизма CT60 A/G (rs 3087243) гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и случайной (контрольной) выборке представлены в табл. 5.

Аллель G полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 – более частое явление для пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ (73 %), по сравнению с группой контроля (61 %), OR = 1,73, 95 % CI: 1,07–2,78. Однако анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 среди больных СД1 без АтЩЖ доноров выявил следующие различия, близкие к достоверным: p = 0,0314 для «редкого» аллеля, p = 0,0507 для гомозигот по «редкому» аллелю (OR = 1,42, 95 % CI: 1,00–1,97). Согласно данным других исследователей, маркер rs 3087243 гена CTLA-4 высоко достоверно ассоциирован с СД1 [22]. В связи с этим полученные нами данные, по-видимому, обусловлены малой выборкой исследуемых групп.

Таблица 5

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и в контрольной группе

Результаты исследования частот аллельных вариантов и генотипов полиморфизма CT60 A/G (rs 3087243) гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и пациентов с СД1, сочетанным с АИТ, представлены в табл. 6. Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 не выявил статистически значимых различий.

Таблица 6

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, серонегативным по АтЩЖ, и у пациентов с СД1, сочетанным с АИТ

В настоящее время не решен вопрос о взаимном влиянии отдельных локусов гена CTLA-4 и вкладе их белковых продуктов в формирование аутоиммунного воспаления. Поэтому исследования в этом направлении необходимо продолжить.

Выводы

Таким образом, полученные нами данные подтверждают результаты других исследователей о том, что СД1 ассоциирован с G(GG) в rs231775 гена CTLA-4.

При этом мы не получили доказанную ассоциацию данного полиморфизма с СД1 в сочетании с АИТ.

Пациенты с сочетанием СД1 с АИТ по распределению rs231775 ближе к норме по сравнению с изолированным СД1.

Для полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 нами не выявлено достоверной ассоциации ни с одной из исследованных групп, что скорее всего связано с их малочисленностью.

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов, связанных с рукописью.

Источник финансирования – работа выполнена на средства, выделенные для Федеральной целевой программы «Сахарный диабет».

Рецензенты:

Алексеев Л.П., д.м.н., профессор, зам. директора, заведующий отделом иммуногенетики, ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА, г. Москва;

Кондраченко М.Ю., д.м.н., профессор, ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» МЗ РФ, г. Пенза.

Работа поступила в редакцию 28.11.2014.