В последние десятилетия большое внимание уделяется повышению безопасности фармакотерапии различных заболеваний как при создании новых лекарственных средств, так и в процессе клинического использования препаратов в виде оптимизации их применения [1; 4].
Иммунная и кроветворная системы являются одними из основных индикаторов состояния гомеостаза организма [9]. Всё многообразие иммунных реакций направлено на поддержание физиологического равновесия, что и объясняет высокую чувствительность иммунной системы к различным факторам, в частности влиянию лекарственных средств. Экспериментальные данные ряда исследователей свидетельствуют, что вид, сила и продолжительность воздействия, а также исходное состояние организма определяют направленность иммунной реакции от глубокой иммуносупрессии до выраженной иммуностимуляции, оказывая при этом на организм иммунопротективное, иммунорегуляторное или иммунопатологическое действие [3, 6, 2].
Одно из центральных мест в развитии медикаментозных нарушений иммунного реагирования занимают противомикробные препараты. Более шестидесяти лет в качестве основного препарата для терапии лепры используют дапсон [8], также успешно применяющийся и для лечения и профилактики ряда других заболеваний, таких как герпетиформный дерматит Дюринга, туберкулез, малярия, пневмоцистная пневмония, токсоплазмоз, кожный лейшманиоз, мицетома, провоцируемая актиномицетами; ревматоидный артрит, субкорнеальный дерматоз и некоторых других.
Несмотря на высокую фармакологическую активность, препарат обладает рядом негативных эффектов, обусловленных формированием в ходе метаболизма гидроксиламин-производных. Наряду с нарушениями со стороны сердечно-сосудистой системы, кожных покровов, органов ЖКТ, дапсон нередко проявляет и гематотоксическое действие, вызывая поражения системы крови (дозозависимый гемолиз с понижением уровня гемоглобина и повышением числа ретикулоцитов, гемолитическая анемия, метгемоглобинемия, гипопластическая анемия, агранулоцитоз) [8]. Высокий процент возникновения перечисленных выше нежелательных дапсон-индуцированных лекарственных реакций требует активного поиска оптимальных способов их коррекции.
Целью нашей работы явилось исследование возможных корригирующих свойств известного биорегулятора – альфа-токоферола и синтетического антиоксиданта – эмоксипина – в отношении показателей иммунореактивности у лабораторных животных, получающих дапсон.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на 360 белых нелинейных крысах-самцах 3-х возрастных групп: 1,5–2 мес. (75–120 г), 6–8 мес. (210–280 г), 20–24 мес. (260–350 г). Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении. Все крысы были синхронизированы по питанию при свободном доступе к воде.
Проведено три серии экспериментов в весенне-летний период. Животные каждой серии были разделены на группы по 10 особей в каждой: 1-ю составляли контрольные крысы, получавшие эквиобъем дистиллированной воды; 2-ю – особи, получавшие внутрижелудочно дапсон (фирма «Novartis») в дозе 25 мг/кг в течение 14 дней; 3-ю – животные, получавшие внутрижелудочно дапсон в дозе 25 мг/кг в комбинации с α-токоферолом per os в дозе 5 мг/кг в течение 14 дней, 4-ю группу – животные, получавшие внутрижелудочно дапсон в дозе 25 мг/кг и эмоксипин в/м в дозе 5 мг/кг в течение 14 дней.
По завершению эксперимента животных забивали под хлороформным наркозом. Забирали кровь, органы, лапы.
Все манипуляции с животными осуществляли согласно Международным правилам GLP [5, 10].
Иммунный статус животных оценивали на основании стандартных иммунофармакологических тестов: реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) с определением индекса реакции (I-серия), реакции прямой гемагглютинации (РПГА) с определением титра антител (II-серия), изучения лейкоцитарной формулы, определения массы и клеточности иммунокомпетентных органов (III-серия) [7].
Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакетов программ: Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, США), BIOSTAT 2008 Professional 5.1.3.1. с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони.
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ иммунореактивности показал, что на фоне применения дапсона происходит подавление клеточно-опосредованной РГЗТ и процесса антителообразования только у старых животных: индекс РГЗТ и титр антител в РПГА снизились на 20 % (p < 0,05) и 30 % (p < 0,05) соответственно. В остальных возрастных группах изменений не выявлено (табл. 1).
У животных, получавших в комбинации с дапсоном α-токоферол, статистически значимые изменения были зафиксированы только в старшей возрастной группе. На фоне введения α-токоферола отмечалось повышение титра антиэритроцитарных антител в сравнении с особями, получавшими только дапсон, на 25 % (p < 0,05), ИР ГЗТ – на 20 % (p < 0,05). У молодых и зрелых животных отмечалась лишь тенденция к активации иммунореактивности (табл. 1).
Воздействие эмоксипина на фоне применения дапсона имело по направленности сходный характер, но статистически значимыми изменения не являлись (табл. 1).
В процессе исследования было также установлено, что при воздействии дапсона у молодых и зрелых животных отмечаются тенденции к угнетению процессов пролиферации в иммунокомпетентных органах, о чём свидетельствовало снижение массы селезенки и тимуса в среднем на 15 % (p > 0,05). У старых крыс данные изменения были более выражены (p < 0,05): количество спленоцитов и тимоцитов у молодых и зрелых животных уменьшилось относительно контроля на 10 % (p > 0,05), у старых крыс-самцов в среднем на 25 % (p < 0,05) (табл. 2).
Применяемые антиоксиданты в условиях дапсон-индуцированных нарушений (табл. 2) оказывали влияние на активность пролиферативных процессов, но статистически значимым это влияние было лишь у старых животных (p < 0,05). Воздействие α-токоферола в сравнении с эмоксипином было более выраженным.
При оценке показателей лейкопоэза в условиях введения дапсона выявлено снижение общего количества лейкоцитов в среднем на 20 % (p < 0,05) во всех возрастных группах. В лейкоцитарной формуле отмечалось достоверное снижение эозинофилов более чем на 40 % у молодых и зрелых (p < 0,05, p < 0,001) и на 75 % (p < 0,001) у старых животных, сегментоядерных нейтрофилов в среднем на 25 % у молодых и зрелых особей (p > 0,05) и более чем на 40 % (p < 0,05) у старых крыс, также следует отметить статистически значимое увеличение палочкоядерных форм нейтрофилов: у молодых на 60 %, у зрелых в 1,5 раза и у старых животных почти на 100 % (табл. 3).
Таблица 1
Влияние антиоксидантов на формирование РГЗТ и РПГА у разновозрастных крыс-самцов на фоне применения дапсона
|
Группы (n = 10) Показатели (M ± m) |
Контроль |
Дапсон (25 мг/кг) |
Дапсон (25 мг/кг) + α-ТФ (5 мг/кг) |
Дапсон (25 мг/кг) + Э (5 мг/кг) |
|
Крысы-самцы 1,5–2 мес. |
||||
|
ИР ГЗТ, % |
10,21 ± 0,7 |
10,11 ± 0,9 |
12,28 ± 1,1 |
11,84 ± 1,0 |
|
Титр антител в РПГА, lg |
1,55 ± 0,1 |
1,50 ± 0,09 |
1,67 ± 0,1 |
1,59 ± 0,1 |
|
Крысы-самцы 6–8 мес. |
||||
|
ИР ГЗТ, % |
11,78 ± 1,1 |
11,70 ± 0,8 |
12,01 ± 1,0 |
12,87 ± 1,1 |
|
Титр антител в РПГА, lg |
1,47 ± 0,9 |
1,42 ± 0,9 |
1,56 ± 0,1 |
1,61 ± 0,1 |
|
Крысы-самцы 20 – 24 мес. |
||||
|
ИР ГЗТ, % |
21,63 ± 2,2 |
16,82 ± 1,0* |
20,41 ± 1,0# |
19,81 ± 1,2 |
|
Титр антител в РПГА, lg |
1,90 ± 0,2 |
1,29 ± 0,2* |
1,62 ± 0,1# |
1,57 ± 0,1 |
Примечания: * – p < 0,05 – относительно контроля; # – p < 0,05 – относительно животных, получавших дапсон (t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений); α-ТФ – α-токоферол, Э – эмоксипин.
Таблица 2
Влияние антиоксидантов на массу и клеточность иммунокомпетентных органов разновозрастных крыс-самцов на фоне применения дапсона
|
Показатели (M ± m) Группы (n = 10) |
Масса селезенки, мг |
Кол-во спленоцитов в 1 мг органа, ∙105 |
Масса тимуса, мг |
Кол-во тимоцитов в 1 мг органа, ∙105 |
|
Крысы-самцы 1,5–2 мес. |
||||
|
Контроль |
367,1 ± 19,7 |
126,2 ± 7,3 |
110,3 ± 7,8 |
42,3 ± 3,4 |
|
Дапсон (25 мг/кг) |
310,1 ± 20,8 |
110,3 ± 6,5 |
95,4 ± 6,7 |
39,1 ± 2,7 |
|
Дапсон (25 мг/кг) + α-ТФ (5мг/кг) |
359,6 ± 19,1 |
120,3 ± 7,8 |
101,2 ± 5,9 |
41,4 ± 2,8 |
|
Дапсон (25 мг/кг) + Э (5 мг/кг) |
352,1 ± 18,2 |
116,2 ± 6,4 |
98,6 ± 5,2 |
39,7 ± 3,1 |
|
Крысы-самцы 6–8 мес. |
||||
|
Контроль |
377,1 ± 19,3 |
115,4 ± 6,3 |
73,4 ± 7,6 |
32,5 ± 2,8 |
|
Дапсон (25 мг/кг) |
322,8 ± 19,5 |
99,2 ± 5,5 |
65,3 ± 5,6 |
30,3 ± 2,7 |
|
Дапсон (25 мг/кг) + α-ТФ (5мг/кг) |
368,4 ± 18,1 |
110,1 ± 6,8 |
69,7 ± 6,1 |
31,3 ± 2,2 |
|
Дапсон (25 мг/кг) + Э (5 мг/кг) |
359,2 ± 17,6 |
106,2 ± 6,4 |
68,3 ± 5,4 |
29,9 ± 2,6 |
|
Крысы-самцы 20–24 мес. |
||||
|
Контроль |
352,4 ± 17,3 |
73,2 ± 5,3 |
29,4 ± 3,4 |
29,5 ± 2,5 |
|
Дапсон (25 мг/кг) |
292,1 ± 16,5* |
50,3 ± 4,5** |
20,3 ± 2,7* |
21,6 ± 2,7* |
|
Дапсон (25 мг/кг) + α-ТФ (5мг/кг) |
348,6 ± 18,1# |
67,4 ± 5,8# |
27,2 ± 2,1# |
31,2 ± 2,3# |
|
Дапсон (25 мг/кг) + Э (5 мг/кг) |
342,1 ± 18,6# |
60,1 ± 6,1 |
24,7 ± 2,2 |
30,4 ± 2,6# |
Примечания: * – p < 0,05; ** – p < 0,01 – относительно контроля; # – p < 0,05 – относительно животных, получавших дапсон (t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений); α-ТФ – α-токоферол, Э – эмоксипин.
При комбинированном применении дапсона как с α-токоферолом, так и эмоксипином количество лейкоцитов оставалось в пределах «нормы». Следует отметить, что более выраженное действие оказал аналог природного антиоксиданта – α-токоферол. Анализ лейкограммы показал, что применение α-токоферола совместно с дапсоном способствовало устранению ингибирующего влияния последнего: количество эозинофилов у молодых особей практически не отличалось от показателей контрольной группы, у зрелых было выше относительно группы, получавшей только дапсон, – на 35 % (p < 0,001), у старых крыс – более чем в 3,5 раза (p < 0,001). Под действием антиоксиданта уменьшалось негативное влияние и на сегментоядерное звено: количество нейтрофилов у молодых и зрелых крыс в этих группах по сравнению с «дапсоном» в среднем было выше на 25 % (p > 0,05), у старых животных на 55 % (p < 0,001). Кроме того, применение α-токоферола сопровождалось снижением палочкоядерных форм нейтрофилов. При применении эмоксипина выявлены идентичные тенденции, но несколько менее выраженные (табл. 3).
Таблица 3
Влияние антиоксидантов на показатели лейкоцитарной формулы животных на фоне применения дапсона
|
Группы (n = 10) Показатели (M ± m) |
Контроль |
Дапсон (25 мг/кг) |
Дапсон (25 мг/кг) + α-ТФ (5 мг/кг) |
Дапсон (25 мг/кг) + Э (5 мг/кг) |
|
Крысы-самцы 1,5–2 мес. |
||||
|
Общее количество лейкоцитов, ∙109/л |
12,8 ± 0,9 |
10,2 ± 0,8* |
12,7 ± 0,9# |
12,1 ± 1,0 |
|
Эозинофилы, % |
2,5 ± 0,4 |
1,4 ± 0,05* |
2,7 ± 0,3## |
2,3 ± 0,4# |
|
Палочкоядерные нейтрофилы, % |
6,0 ± 0,7 |
9,5 ± 0,2*** |
5,1 ± 0,5### |
7,2 ± 0,6## |
|
Сегментоядерные нейтрофилы, % |
11,0 ± 1,2 |
7,6 ± 2,1 |
9,7 ± 0,8 |
8,9 ± 0,9 |
|
Лимфоциты, % |
70,3 ± 2,6 |
74,1 ± 3,1 |
73,4 ± 2,1 |
74,0 ± 2,9 |
|
Моноциты, % |
10,4 ± 1,2 |
7,1 ± 1,3 |
8,9 ± 2,8 |
8,1 ± 2,7 |
|
Крысы-самцы 6–8 мес. |
||||
|
Общее количество лейкоцитов, ∙109/л |
13,1 ± 1,0 |
10,1 ± 0,9* |
12,5 ± 0,8# |
12,0 ± 0,9 |
|
Эозинофилы, % |
10,2 ± 0,2 |
6,2 ± 0,2*** |
8,4 ± 0,3### |
7,7 ± 0,4## |
|
Палочкоядерные нейтрофилы, % |
3,7 ± 1,2 |
9,4 ± 1,4* |
4,9 ± 1,4# |
7,4 ± 1,5 |
|
Сегментоядерные нейтрофилы, % |
37,4 ± 3,2 |
28,8 ± 2,9 |
35,0 ± 2,4 |
32,1 ± 1,8 |
|
Лимфоциты, % |
39,7 ± 3,2 |
48,1 ± 2,8 |
43,3 ± 1,3 |
44,8 ± 1,7 |
|
Моноциты, % |
8,9 ± 1,5 |
7,3 ± 1,6 |
8,1 ± 1,8 |
8,0 ± 1,9 |
|
Крысы-самцы 20–24 мес. |
||||
|
Общее количество лейкоцитов, ∙109/л |
13,5 ± 1,1 |
10,7 ± 0,8* |
13,2 ± 0,9# |
12,6 ± 0,9 |
|
Эозинофилы, % |
4,6 ± 0,05 |
1,2 ± 0,05*** |
4,3 ± 0,06### |
3,6 ± 0,5### |
|
Палочкоядерные нейтрофилы, % |
4,2 ± 0,5 |
8,3 ± 0,2*** |
3,5 ± 0,2### |
5,9 ± 0,7## |
|
Сегментоядерные нейтрофилы, % |
28,3 ± 2,4 |
16,4 ± 1,3** |
25,5 ± 1,1### |
21,9 ± 2,2# |
|
Лимфоциты, % |
53,5 ± 4,5 |
68,3 ± 5,9 |
58,5 ± 2,3 |
56,4 ± 3,7 |
|
Моноциты, % |
9,6 ± 1,7 |
5,9 ± 0,9 |
8,2 ± 0,8 |
7,8 ± 0,7 |
Примечания: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** p < 0,001 – относительно контроля; # – p < 0,05; ## – p < 0,01; ### – p < 0,001 – относительно животных, получавших дапсон (t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений); α-ТФ – α-токоферол; Э – эмоксипин.
Выводы
Таким образом, α-токоферол и эмоксипин, применяемые на фоне введения дапсона, влияют на показатели гуморального и клеточного звена иммунитета, пролиферативные процессы в иммунокомпетентных органах и показатели лейкоцитарной формулы, оказывая корригирующее действие, более выраженное в позднем возрасте.
На основании полученных данных может быть разработан способ коррекции дапсон-индуцированных нарушений для оптимизации терапии дапсоном в дерматологии, в том числе в лепрологии, а также при лечении ряда инфекционных болезней (малярии, пневмоцистной пневмонии и др.).
Рецензенты:
Тризно Н.Н., д.м.н., заведующий кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Астрахань;
Котельников А.В., д.б.н., профессор кафедры «Гидробиология и общая экология», ФГБОУ ВПО «Астраханский технический университет», г. Астрахань.
Работа поступила в редакцию 02.12.2014.