Разработка методик овариальной стимуляции, применяемых при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), привела к тому, что после переноса одного или двух эмбрионов, в большинстве циклов остаются так называемые «лишние» эмбрионы. Замораживание этих эмбрионов с целью подсадки их в последующих циклах является важнейшей задачей в современном лечении бесплодия. Этот подход позволяет уменьшить процент многоплодной беременности и увеличить суммарную частоту наступления беременности после проведения процедуры ВРТ. Необходимым условием для того, чтобы в циклах овариальной стимуляции имелись эмбрионы, достойные последующего замораживания, является наличие сохраненного овариального резерва [1].
Первое сообщение об успешной беременности и родах после размораживания и переноса пациентке ранее замороженных эмбрионов относится к 1984 году [3, 4]. Успеху данной процедуры способствовали разработка в 70-х годах ХХ века технологии замораживания и размораживания эмбрионов млекопитающих разных видов [2].
Существуют два подхода к замораживанию человеческих предимплантационных эмбрионов: медленное и быстрое замораживание (витрификация). Методика медленного замораживания эмбрионов была разработана в 80-х годах прошлого столетия и позволила получить первые стабильные клинические результаты. Однако частота наступления беременности при использовании этой методики относительно низкая. Основной проблемой при медленном замораживании биологических объектов является высокая частота образования кристаллов льда при расширении воды при температуре ниже нуля. Альтернативой медленному замораживанию может служить витрификация биологических объектов. Теоретической базой для этой процедуры были исследования, которые показали, что при очень быстром замораживании воды образование кристаллов льда не происходит, соответственно, вода не расширяется и находится в состоянии, схожем со стеклом. Такой процесс называется витрификацией. В настоящее время метод витрификации успешно используется как для замораживания ооцитов, так и для эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития. Витрификация эмбрионов на четвертый день развития, что соответствует стадии морулы, относительно редко используется для замораживания эмбрионов, в том числе и методом витрификации. В 2002 году австрийские исследователи сообщили о 22 циклах, в которых были разморожены эмбрионы, подвергнутые витрификации на стадии морулы. Из 55 эмбрионов 54 пережили размораживание, 30 эмбрионов у 18 пациенток были перенесены в полость матки, из которых у 5 пациенток наступила беременность (27,8 %), во всех случаях закончившаяся родами. Частота имплантации составила 20 % [9]. Португальские исследователи изучали частоту выживания эмбрионов после витрификации на стадии морулы. Выяснилось, что частота выживания составила 73 %, что было сравнимо с выживанием после размораживания эмбрионов на стадии бластоцисты [10]. Также в работе австрийских исследователей было показано, что витрификация человеческих эмбрионов на стадии морул, при использовании более высоких концентраций криопротекторов, таких как этиленгликоль и ДМСО, приводит к более высокой частоте наступления беременности по сравнению с более низкими концентрациями [11]. Также в литературе имеется сообщение о повторной заморозке эмбрионов на стадии морулы [12]. Следует отметить, что витрификация эмбрионов на четвертые сутки имеет ряд важных преимуществ. Во-первых, на этой стадии еще не формируется полость эмбриона (бластоцель) и нет необходимости проведения специальных манипуляций для уменьшения этой полости, и процесс витрификации проходит проще. Во-вторых, есть возможность культивировать размороженные эмбрионы в течение суток до стадии бластоцисты, что позволяет выбирать более качественные эмбрионы для переноса.
Материалы и методы исследования
В исследование были включены данные 100 последовательных циклов ЭКО/ИКСИ, в которых было проведено замораживание оставшихся после переноса эмбрионов и 100 последовательных циклов, в которых таких эмбрионов не было. Также были исследованы исходы переносов размороженных эмбрионов. Все циклы ЭКО/ИКСИ были проведены в период с мая 2011 года по сентябрь 2012 года в клинике репродукции «Генезис», Санкт-Петербург. Циклы с переносом размороженных эмбрионов были проведены с июля 2011 года по август 2013 года. Из исследования были исключены пациенты, у которых использовались донорские яйцеклетки или сперматозоиды, а также пациенты, участвующие в программе суррогатного материнства. Овариальная стимуляция осуществлялась по стандартному длинному протоколу с использованием агонистов ЛГ-РГ или по протоколу с антагонистами. Препараты, содержащие ФСГ, были использованы как рекомбинантного, так и мочевого происхождения. Оплодотворение и культивирование эмбрионов было осуществлено с помощью сред компании «Ориджио», Дания. Витрификацию эмбрионов осуществляли на четвертые сутки развития с использованием растворов, содержащих следующие криопротекторы: этиленгликоль, фиколл, сахароза, трегалоза (ЗАО «Протеинсинтез», Россия). После размораживания эмбрионы помещались в те же среды, в которых они культивировались, и перенос в полость матки пациенток осуществлялся через сутки. Во всех случаях было перенесено по два эмбриона. При математической обработке числовых данных был использован t-Стьюдент тест, для дихотомических данных χ-квадрат тест. Уровень статистической значимости был принят Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Показаниями для применения процедуры ЭКО/ИКСИ в обеих группах пациенток служили мужской фактор, трубный фактор, эндометриоз, ановуляция, необъяснимое бесплодие, а также сочетание приведенных причин. В обеих группах распределение причин статистически не различалось, за исключением наличия эндометриоза. В группе, где были получены эмбрионы годные для замораживания, у 6 пациенток (6 %) был диагностирован эндометриоз, тогда как в группе без замораживания эмбрионов таких пациенток было 23 (23 %), различия между группами статистически достоверные (Р = 0,001).
При анализе клинических параметров пациентов выяснилось, что статистически различались возраст пациенток в обеих исследованных группах, уровень АМГ, продолжительность бесплодия и число предыдущих попыток ЭКО/ИКСИ (табл. 1). В то же время возраст пациентов и показатели спермограммы не различались в обеих группах.
При назначении овариальной стимуляции в обеих группах различалась статистически средняя суммарная доза ФСГ, среднее число полученных яйцеклеток, эмбрионов на третий день развития, а также частота развивающейся беременности после 12 недель в циклах, в которых проводилась овариальная стимуляция (табл. 2).
После того как были завершены переносы эмбрионов в циклах со стимуляцией и оценено количество сообщенных родов, у пациенток с оставшимися эмбрионами и у которых беременность не наступила, в течение последующих двух лет, были проведены протоколы с переносом размороженных эмбрионов. Суммарная частота сообщенных родов в обеих группах показана в табл. 3.
Таблица 1
Клинические характеристики пациентов в обеих группах
|
Клинический параметр |
Группа с замороженными эмбрионами |
Группа без замороженных эмбрионов |
Р |
|
Возраст пациенток, годы |
32,8 ± 0,4 |
36,2 ± 0,5 |
< 0,0001 |
|
АМГ, нг/мл |
3,2 ± 0,3 |
1,2 + 0,1 |
< 0,0001 |
|
Продолжительность бесплодия, годы |
5,2 ± 0,3 |
7,3 ± 0,4 |
< 0,0001 |
|
Число предыдущих попыток |
0,7 ± 0,1 |
1,1 ± 0,2 |
0,02 |
Таблица 2
Показатели овариальной стимуляции и частота наступления беременности в обеих группах
|
Клинический параметр |
Группа с замороженными эмбрионами |
Группа без замороженных эмбрионов |
Р |
|
Суммарная доза ФСГ, мЕд |
2215 ± 67 |
3155 ± 88 |
< 0,0001 |
|
Число полученных яйцеклеток |
12,8 ± 0,6 |
6,6 ± 0,5 |
< 0,0001 |
|
Число эмбрионов на третий день развития |
8,1 ± 0,3 |
2,9 ± 0,2 |
< 0,0001 |
|
Частота развивающейся беременности после 12 недель |
41 % |
19 % |
0,001 |
Таблица 3
Суммарная частота сообщенных родов в исследованных группах
|
Суммарная частота родов |
Группа с криоконсервацией эмбрионов |
Группа без криоконсервации эмбрионов |
Р |
|
Перенос в цикле стимуляции |
33 % |
16 % |
0,008 |
|
Первый перенос размороженных эмбрионов |
43 % |
‒ |
‒ |
|
Второй перенос размороженных эмбрионов |
48 % |
‒ |
‒ |
|
Итого |
48 % |
16 % |
0,0001 |
Наличие эмбрионов, оставшихся после переноса в цикле овариальной стимуляции, является важным критерием прогноза успешных родов при проведении процедуры ВРТ. Пациентки с замороженными эмбрионами были более молодого возраста, у них был выше АМГ, меньшая продолжительность бесплодия и меньше предшествующих попыток ВРТ. С клинической точки зрения в этой группе реже встречался эндометриоз, и при овариальной стимуляции требовалась меньшая суммарная доза препаратов ФСГ. В то же время число полученных яйцеклеток и эмбрионов было больше. Частота наступления беременности и родов была выше в цикле овариальной стимуляции. Более того, в группе с замораживанием эмбрионов дальнейшее использования размороженных эмбрионов приводило к увеличению суммарной частоты родов и после двух переносов она достигала 48 %, что в три раза превышало частоту родов у пациенток без замороженных эмбрионов. Все это говорит о высокой клинической эффективности витрификации эмбрионов на четвертый день развития.
Рецензенты:
Гуркин Ю.А., д.м.н., профессор кафедры детской гинекологии и женской репродуктологии ФП и ДПО, ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России, г. Санкт-Петербург;
Костюшов Е.В., д.м.н., профессор, главный врач ГБУЗ ЛО «Сертоловская городская больница», г. Сертолово.
Работа поступила в редакцию 25.11.2014.