Флавоноиды относятся к числу широко распространенных растительных метаболитов, для которых характерно структурное многообразие, высокая разносторонняя биологическая активность и малая токсичность. Направление биологического действия флавоноидов связано с физико-химическими свойствами многообразия их структур [4, 5]. Большое значение придается противовоспалительному действию флавоноидов, с которым, вероятно, связано их противоязвенное, ранозаживляющее и жаропонижающее действие.
Существенным недостатком флавоноидов, снижающим эффективность препаратов на их основе, является их низкая водорастворимость, таким образом, представляет интерес разработка новых лекарственных средств и БАД, обладающих повышенной растворимостью флавоноидов [3, 1, 2].
Целью настоящей работы являлось механохимическое получение и исследование свойств фармацевтических твердых дисперсий/композиций на основе флавоноидов генистеина, дигидрокверцетина, рутина, обладающих повышенной водорастворимостью.
В полученных твердых дисперсиях увеличение растворимости достигалось за счет ионизации молекул флавоноидов, имеющих полифенольную (кислотную) природу, а также путем образования водорастворимых комплексов включения с полисахаридом арабиногалактаном (АГ) по типу «гость-хозяин».
Материалы и методы исследования
Для работы выбраны следующие флавоноиды и вспомогательные вещества:
1. Генистеин – 5,7-дигидрокси-3-(4-гидроксифенил)хромен-4-он, субстанция флавоноида генистеина. Брутто-формула C15H10O5. Получен от Sigma-Aldrich.
2. Дигидрокверцетин (ДГК) – 3,3’,4,5,7-пентагидроксифлавон, субстанция флавоноида дигидрокверцетина, производство ООО ИНПФ «Химия древесины» (Иркутск); серия 9022007. Брутто-формула С15Н12О7.
3. Рутин – 2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-3-[α-L-рамнопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозилокси]-4H-хромен-4-он, субстанция флавоноида рутина, производство Мерк С.А. (Бразилия); серия ММ09-9020. Брутто-формула C27H30O16.
Структурные формулы флавоноидов приве дены ниже.
4. Полисахарид арабиногалактан (Фибролар С) из древесины лиственниц сибирской и Гмелина – аморфный порошок светло-кремового цвета, производство ООО «Химия древесины» (Иркутск), полученный по методу, описанному в работе [6], ТУ 9363-021-39094141-08; серия 02042013. Молекулярная масса – 17,3 кДа [8].
5. Субстанции основного карбоната магния (ФСП 42-3989-08) и осажденного карбоната кальция фармакопейной чистоты (ФСП 42-0550-7545-06).
Механическая обработка. Композиции флавоноидов со вспомогательными веществами получали путем механической обработки смесей порошков на ротационной шаровой мельнице ВМ-1 в течение 4 часов. Объем барабана 300 мл, 15 стальных шаров d = 22 мм и m = 44,3 г, загрузка сырья 20 г, ускорение мелющих тел 1g, скорость вращения барабана 157 об/мин. Образцы представляют собой тонко измельченные порошки с характерной для каждого флавоноида окраской.
Определение растворимости флавоноидов. Полученные порошкообразные композиции растворялись в 5 мл дистиллированной воды при +25 °С при перемешивании 150 об/мин в течение 30 мин. Навеска образца соответствовала массе, необходимой для достижения расчетной концентрации флавоноида 10 г/л. Затем надосадочную жидкость центрифугировали и фильтровали через бумажный фильтр до получения прозрачного раствора. Отобранную аликвоту 1 см3 разбавляли дистиллированной водой до 25 см3. Концентрацию флавоноидов определяли методом ВЭЖХ относительно их специально приготовленных стандартных спиртовых растворов. Анализ ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent 1200 с колонкой Zorbax Eclipse XDB-C18, 4,6×150 мм. Температура колонки – 30 °С; диодно-матричный УФ-детектор. В качестве элюента использовалась система ацетатный буфер – ацетонитрил (соотношение 55:45 для генистеина, 70:30 для дигидрокверцетина, 80:20 для рутина). Детектирование проводилось в диапазоне длин волн 260–291 нм.
Рентгенофазовый и термический анализ. Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов выполняли на дифрактометре ДРОН-3 с использованием CuKα-излучения, скорость вращения счетчика 2 град/мин, I = 1000.
Термический анализ проводили методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с помощью прибора DSC-550 (Instrument Specialists Inc.) в атмосфере аргона. Температурная программа: + 20 – + 250°С, скорость нагрева 10°С/мин.
Результаты исследования и их обсуждение
Твердые дисперсии флавоноидов, включающие карбонаты кальция и магния.
На рис. 1 представлены электронные микрофотографии порошков флавоноидов и их композиций с основным карбонатом магния, механическая обработка композиций – 4 часа.
Из полученных микрофотографий следует, что при механической обработке происходит измельчение частиц исходных компонентов и образование их композитных агрегатов, что согласно ранее проведенным исследованиям [3] способствует быстрому взаимодействию компонентов при гидратации.
Результаты РФА и ДСК приведены на рис. 2. Во всех случаях в необработанных смесях присутствуют характерные для кристаллических фаз флавоноидов рефлексы рентгенограмм и фазовый переход плавления. В механохимически обработанных смесях происходит уменьшение теплот плавления и интенсивностей рефлексов РФА, этот эффект позволяет предположить, что в результате механической обработки происходит частичная потеря кристалличности твердых фаз флавоноидов.
Изменение фазового состояния флавоноидов в результате механической обработки также способствует ускорению перевода флавоноидов в растворенное состояние.
При растворении в воде твердых дисперсий с карбонатами металлов наблюдается значительное повышение растворимости флавоноидов по сравнению с насыщенными растворами субстанций флавоноидов (табл. 1). Это связано с тем, что исследуемые флавоноиды являются полифенольными соединениями, обладающими кислотными свойствами. Однако они, как правило, не образуют твердых фаз солей с ионами металлов, следовательно, невозможно их выделение и использование в виде индивидуальных биоактивных веществ. Тем не менее в щелочных диапазонах рН молекулы флавоноидов способны к ионизации, а ионизованная форма, как правило, имеет более высокую водорастворимость. Таким образом, смещая равновесие в сторону ионизованных молекул путем использования субстанций карбонатов кальция и магния, мы повышаем общую концентрацию флавоноидов в растворе [3].
ФЛ-ОН + ОН– ↔ ФЛ-О– + Н2О.
а б в
г д е
Рис. 1. Микрофотографии порошков генистеина (а), рутина (б), ДГК (в) и твердых дисперсий состава: генистеин – магния карбонат (2:1) (г), рутин – магния карбонат (3:1) (д), ДГК – магния карбонат (2:1) (е)
Таблица 1
Показатели растворимости флавоноидов из их механохимически полученных твердых дисперсий с карбонатами кальция и магния
|
Вещество/композиция (массовые отношения) |
Растворимость флавоноида, г/л |
Увеличение растворимости, разы |
рН раствора композиции |
|
Рутин |
0,065 |
|
|
|
Рутин + MgCO3 (осн.) (3:1) |
2,2 |
33,8 |
8,4 |
|
Рутин + СаCO3 (3:2) |
0,53 |
8,2 |
8,0 |
|
Дигидрокверцетин (ДГК) |
1,47 |
|
|
|
ДГК + MgCO3 (осн.) (2:1) |
22,5 |
15,3 |
7,5 |
|
ДГК + MgCO3 (осн.) (1:1) |
17,8 |
12,1 |
7,7 |
|
ДГК + MgCO3 (осн.) (1:2) |
16,3 |
11,1 |
7,6 |
|
ДГК + СаCO3 (2:1) |
4,5 |
3,1 |
7,1 |
|
ДГК + СаCO3 (1:1) |
5,0 |
3,4 |
7,0 |
|
ДГК + СаCO3 (1:2) |
6,0 |
4,1 |
7,3 |
|
Генистеин |
0,008 |
|
|
|
Генистеин + MgCO3 (осн.) (2:1) |
0,81 |
101,3 |
9,1 |
|
Генистеин + MgCO3 (осн.) (1:1) |
0,69 |
86,3 |
9,2 |
а б
в г
д е
Рис. 2. Рентгенограммы (а, б, в) и термограммы ДСК (г, д, е) исходных флавоноидов (1): генистеина (а, г), рутина (б, д), дигидрокверцетина (в, е); MgCO3 (2), а также смеси флавоноидов и MgCO3 до (3) и после (4) механической обработки в течение 4 часов в шаровой валковой мельнице. Состав смесей: генистеин – MgCO3 (2:1), рутин – MgCO3 (3:1), дигидрокверцетин – MgCO3 (2:1)
Как видно из данных табл. 1, увеличение растворимости зависит от природы карбоната металла – более щелочной карбонат магния является более эффективным. Также растворимость зависит от соотношения флавоноида с карбонатом в композиции, но менее, чем от природы карбоната.
Твердые дисперсии флавоноидов, включающие полисахарид арабиногалактан
Для получения комплексов включения в качестве комплексообразователя использовался АГ – полисахаридный метаболит древесины лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина. Макромолекула АГ имеет высоко разветвленное строение. Эта особенность, по нашему мнению, способствует образованию прочных межмолекулярных комплексов действующих веществ, молекулы которых вероятнее всего, могут связываться межмолекулярными водородными связями в пространстве, образованном боковыми цепями [7].
На рис. 3 представлены электронные микрофотографии порошков композиций флавоноидов с АГ, механическая обработка композиций – 4 часа.
а б в
Рис. 3. Микрофотографии порошков твердых дисперсий состава: генистеин – АГ (1:10) (а), рутин – АГ (1:10) (б), ДГК – АГ (1:10) (в)
Результаты РФА и ДСК приведены на рис. 4. В образцах состава флавоноид-АГ невозможно достоверно выделить пик, соответствующий плавлению флавоноида, вероятно, вследствие термического разложения АГ.
а б
Рис. 4. Рентгенограммы (а) и термограммы ДСК (б) исходного ДГК (1), АГ (2), а также смеси ДГК и АГ (1:10) до (3) и после (4) механической обработки в течение 4 часов в шаровой валковой мельнице
В результате механической обработки флавоноидов с АГ, наряду с нарушением кристаллической структуры флавоноидов, вероятно, происходило диспергирование их молекул в матрицу водорастворимого полисахарида, что также способствовало их ускоренному высвобождению в раствор и образованию межмолекулярных комплексов при гидратации. Данные по изменению растворимости флавоноидов из смесей с АГ приведены в табл. 2. Во всех исследованных случаях имеет место повышение растворимости флавоноидов, которое, однако, меньше значений, приведенных в табл. 1.
Таблица 2
Показатели растворимости флавоноидов из их механохимически полученных твердых дисперсий с арабиногалактаном
|
Вещество/композиция (массовое отношение) |
Растворимость вещества/композиции, г/л |
Увеличение растворимости в n раз |
|
Рутин |
0,065 |
|
|
Рутин + АГ (1:10) |
0,07 |
1,1 |
|
Рутин + АГ (1:20) |
0,09 |
1,4 |
|
Дигидрокверцетин (ДГК) |
1,47 |
|
|
ДГК + АГ (1:10) |
> 4,16 |
2,2−2,8 |
|
ДГК + АГ (1:20) |
> 4,01 |
|
|
Генистеин |
0,008 |
|
|
Генистеин + АГ (1:10) |
0,074 |
9,3 |
Выводы
Рассмотрены получение и свойства твердых дисперсий флавоноидов и вспомогательных веществ, способствующих повышению их водорастворимости. Проведенные исследования образцов продемонстрировали во всех случаях значительное (до ~ 10–100 раз) увеличение растворимости флавоноидов в механохимически полученных образцах по сравнению с растворимостью исходных субстанций флавоноидов. Показано, что повышение водорастворимости за счет кислотных свойств биофлавоноидов значительно превышает аналогичные показатели по сравнению с образованием межмолекулярных комплексов с АГ.
Полученные результаты открывают перспективы создания лекарственных средств и биологически активных добавок повышенной эффективности.
Работа выполнена при поддержке проекта V.48.1. программы фундаментальных исследований государственных академий наук.
Рецензенты:
Поляков Н.Э., д.х.н., вед. научн. сотрудник Института химической кинетики и горения СО РАН, г. Новосибирск;
Толстикова Т.Г., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией фармакологических исследований Новосибирского института органической химии СО РАН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 18.11.2014.