Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Одними из хорошо изученных маркеров, характеризующих дисфункцию эндотелия, являются оксид азота и эндотелин. В норме уровень эндотелина чрезвычайно низкий, однако под воздействием различных факторов (гипоксия, ишемия, стресс) стимулируется его синтез. Известно, что эндотелин оказывает мощное вазоконстрикторное действие, может способствовать внутрисосудистому свертыванию крови [3]. Регуляторное действие оксида азота (NO) в организме обеспечивается его генерацией из L-аргинина, катализируемой изоформами NO-синтаз (NOS) [10]. Показано, что физиологические концентрации NO играют важную роль в регуляции функций иммунной системы, эндотелия сосудов, нейротрансмиссии, поддержании гемостаза. В то же время недостаток, как и избыток NO может вызывать ряд патологических состояний (тромбообразование, ишемию органов, дисбаланс регуляторных систем) [9]. Представляется вероятным, что активность определенных изоформ NOS, являющихся продуктами экспрессии соответствующих генов (NOS1-3), может обеспечивать различную концентрацию NO в организме и таким образом определять его функцию как физиологического регулятора либо как токсического агента. Так, в ряде работ продемонстрировано уменьшение концентрации NO в кровеносном русле у носителей полиморфного участка 786С гена eNOS [11]. Кроме того, и изменение концентрации эндотелина у пациентов с мутациями в соответствующем гене может стать значимым в развитии и усугублении дисфункции эндотелия. К настоящему времени роль дисфункции эндотелия продемонстрирована в патогенезе гриппа А H1N1pdm09 у взрослого контингента населения, в том числе и в случае формирования вторичной вирусно-бактериальной пневмонии с развитием синдрома острого повреждения легких [4, 5]. Имеются единичные работы и по изучению генетического полиморфизма молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия при пневмонии у взрослых в сезон эпидемиологического неблагополучия по гриппу 2009–2010 гг. [2, 6]. Однако подобные исследования не затронули детского населения. В связи с чем представляется актуальным поиск генетических критериев, характеризующих дисфункцию эндотелия при гриппе у детей с целью прогнозирования тяжести течения инфекции и формирования осложнений.

Цель исследования – изучить частоту встречаемости генотипов полиморфного маркера гена эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn) и синтазы окиси азота (NOS3 C786T) у детей с неосложненным гриппом и при осложненном его течении пневмонией.

Материалы и методы исследования

В исследование включен 201 ребенок с гриппом АH1N1pdm09, рандомизированный в две группы: первую группу составили 114 детей с неосложненным гриппом. Для определения тяжести течения гриппа А H1N1pdm09 пользовались общепринятой классификацией гриппа [7]. Группу сравнения для этой группы составили 27 детей с сезонным гриппом A H3N2 в постэпидемический период. 87 детей с развившейся внебольничной вторичной вирусно-бактериальной пневмонией на фоне пандемического гриппа объединены во вторую группу. Диагноз внебольничной пневмонии устанавливался на основании достоверных критериев, предложенных А.Г. Чучалиным и соавт. [1]. В качестве критериев тяжести внебольничной пневмонии у детей использовали модифицированную шкалу тяжелых внебольничных пневмоний у взрослых (2007) [8]. Группу сравнения для второй клинической группы составили 50 детей с внебольничной пневмонией в постэпидемический по гриппу период. Дети с атипичной этиологией внебольничной пневмонии (микоплазменная, хламидийная) из данной группы исключались.

Диагноз гриппа А H1N1pdm09 устанавливался на основании эпидемиологического анамнеза, комплекса характерных клинических симптомов и верифицировался путем обнаружения РНК вируса в назофарингеальных мазках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в парных сыворотках с нарастанием титра антител. Сезонный грипп устанавливался на основании идентификации РНК вируса гриппа A H3N2 в назофарингеальных мазках.

Распределение исследуемых по группам, полу и возрасту представлено в табл. 1.

Таблица 1

Распределение больных по группам, полу и возрасту

В качестве контрольной группы для оценки распределения генотипов исследуемых полиморфизмов в популяции обследовано 200 здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точка мутации эндотелина-1 (EDN1) в позиции 198 (Lys > Asn) и эндотелиальной синтазы окиси азота (NOS3) в позиции 786 (C > T). Амплификацию проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» – М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров НПФ «Литех»-«SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия, проходящем в ультрафиолетовом свете.

Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы «BIOSTAT». При сравнении частот и групп по качественному бинарному признаку пользовались критерием χ2. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди – Вайнберга. С целью оценки ассоциаций аллелей с генотипом рассчитывали относительный риск (ОР) и отношение шансов (ОШ).

Результаты исследования и их обсуждение

Распределение распространенности генотипов полиморфного локуса С786Т гена NOS3 и Lys198Asn гена EDN1 в группе больных с различным течением гриппа и контрольной группе соответствовало ожидаемому равновесию Харди – Вайнберга.

По данным распределения распространенности генотипов гена NOS3 С786Т у больных с различным течением гриппа получены достоверные различия с группой здоровых лиц (табл. 2).

Таблица 2

Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов NOS3 (C786T) среди больных с гриппом

Примечания: * – статистическая значимость различий с контролем; ** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения.

При этом отмечено, что данные различия затрагивают группу пациентов с тяжелым течением гриппа А H1N1pdm09 и в случае развития пневмонии, ассоциированной с этим вирусом. Так, частота генотипа С/С, С/Т и Т/Т у больных с гриппом A H3N2, а также у детей с легким и среднетяжелым течением пандемического гриппа не отличалась от группы контроля (соответственно р = 0,184, р = 0,17, р = 0,071). Кроме того, у детей с легким и среднетяжелым проявлением инфекции гриппа А H1N1pdm09 частота выявляемой распространенности различных генотипов полиморфного варианта гена NOS3 была сопоставима с таковой у пациентов при сезонном гриппе (р = 0,96, р = 0,853). Тяжелое течение гриппа А H1N1pdm09 сопровождалось достоверно частым обнаружением генотипа С/С и генотипа Т/Т полиморфного локуса С786Т гена NOS3 не только в сравнении с группой здоровых лиц, но и больных с сезонным гриппом (р = 0,0001), а также пациентов с легким и среднетяжелым течением пандемического гриппа (р = 0,003). Частота генотипов С/С и Т/Т отличалась от группы контроля только у больных с пневмонией в сезон циркуляции вируса гриппа А H1N1pdm09 как при тяжелом, так и нетяжелом ее течении (р = 0,05, р = 0,0001 соответственно). Частота генотипа С/Т отличалась от здоровых лиц только при тяжелом течении пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 (р = 0,0001). Тяжелая пневмония у детей в период циркуляции гриппа характеризовалась достоверно частым обнаружением генотипа Т/Т в сравнении не только с группой контроля, но и группой сравнения (р = 0,0001). В то же время статистически значимые различия распределения генотипов NOS3 (C786T) при различном течении пневмонии при гриппе нами не выявлены. Частота генотипа С/Т отличалась от здоровых лиц только при тяжелом течении пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 (р = 0,0001). Тяжелая пневмония у детей в период циркуляции гриппа характеризовалась достоверно частым обнаружением генотипа Т/Т в сравнении не только с группой контроля, но и группой сравнения (р = 0,0001). В то же время статистически значимые различия распределения генотипов NOS3 (C786T) при различном течении пневмонии при гриппе нами не выявлены.

При сравнении частоты аллельных вариантов гена NOS3 С786Т в группе обследуемых как с пандемическим гриппом, так и сезонным статистически значимая разница от группы контроля не выявлена, а в случае развития пневмонии данные отличия касались только тяжелого течения пневмонии при гриппе (р = 0,003) (табл. 2). Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию аллеля Т гена NOS3 полиморфизма C786T с тяжелым течением пневмонии при гриппе (ОР = 1,5, ДИ [–1,0; 3,21]). Генотип Т/Т полиморфизма гена NOS3 (С786Т) ассоциирован с развитием тяжелого гриппа (ОР 1,16 при доверительном интервале – ДИ от –1,11 до 1,9), а генотип С/Т при легком и среднетяжелом его течении проявляет себя как протективный фактор (соответственно, ОР 0,97, ДИ [–1,41; 1,27]; ОР 0,99, ДИ [–1,27; 1,23]).

Распределение генотипов EDN1 Lys198Asn и частоты его аллельных вариантов у здоровых лиц и у пациентов с различным течением гриппа представлено в табл. 3.

Таблица 3

Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов EDN1 (Lys198Asn) среди больных с гриппом

Примечания: * – статистическая значимость различий с контролем, ** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения.

Распространенность генотипов Lys/Lys и Lys/Asn оказалась одинаково частой у здоровых детей и у больных с сезонным гриппом (р = 0,866), а также у пациентов с легким (р = 0,139) и среднетяжелым течением гриппа А H1N1pdm09 (р = 0,176). В то же время генотип Lys/Asn EDN1 в 1,4 раза чаще регистрировался у пациентов с тяжелым течением пандемического гриппа по сравнению со здоровыми лицами (р = 0,0001) и в 2,2 раза чаще, чем у пациентов с сезонным гриппом (р = 0,007). Кроме того, у детей при тяжелом течении гриппа А H1N1pdm09 распространенность генотипа Asn/Asn полиморфного локуса EDN1 Lys198Asn оказалась повышенной относительно группы контроля (р = 0,0001). Среди пациентов других исследуемых групп данный генотип нами не обнаруживался. Распределение генотипов Lys/Lys, Lys/Asn и Asn/Asn оказалось одинаково частым у здоровых детей и у больных с нетяжелым и тяжелым течением внебольничной пневмонии, этиологически не связанной с вирусом гриппа (соответственно р = 0,102, р = 0,161). Кроме того, частота выявления этих генотипов не отличалась и у пациентов с различной тяжестью течения внебольничной пневмонии вне эпидемического сезона по гриппу (р = 0,26). В то же время у детей при тяжелой пневмонии, обусловленной пандемическим вирусом гриппа, частота регистрации исследуемых генотипов отличалась не только от группы здоровых лиц, но и от пациентов группы сравнения (р = 0,022) и детей с нетяжелым течением пневмонии в сезон циркуляции гриппа А H1N1pdm09 (р = 0,04). У пациентов при тяжелом течении пневмонии при гриппе относительно детей группы сравнения с тяжелым течением пневмонии генотип Asn/Asn обнаруживался чаще в 2,2 раза, а генотип Lys/Asn – чаще в 1,9 раза.

Сравнивая частоту аллельных вариантов гена EDN1 Lys198Asn, выявили, что при тяжелом течении пандемического гриппа аллель Asn встречается с частотой 0,61, что достоверно реже, чем у здоровых индивидуумов и пациентов с легким и среднетяжелым течением гриппа А H1N1pdm09, а также у детей при сезонном гриппе (табл. 3). Обнаружение аномальной Asn-аллели чаще наблюдалось у детей с тяжелым течением гриппозной инфекции в сравнении как с группой контроля, так и пациентами остальных исследуемых групп (р = 0,0001). А расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с тяжелым течением пандемического гриппа (ОР = 3,38, ДИ [1,97; 4,65]). В случае развития пневмонии при пандемическом гриппе отмечалось более редкое обнаружение аллели Lys (р = 0,0001). Соответственно, мутантная аллель Asn у детей при гриппе, осложненном пневмонией, выявлялась чаще в сопоставлении со здоровыми индивидуумами и пациентами группы сравнения (соответственно р = 0,0001, р = 0,002). Достоверных отличий распространенности аллели Asn у детей с различной тяжестью течения пневмонии при гриппе нами не выявлено (р = 0,182). Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с тяжелым течением пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 (ОР = 1,37, ДИ [-0,39; 2,12]). Тогда как аллель Lys при тяжелом течении пневмонии у детей с гриппом оказывала протективное действие (ОР = 0,72, ДИ [–2,12; 0,39]).

Таким образом, определение полиморфизма генов молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия, дает возможность осуществлять индивидуальный прогноз тяжести и характера течения пандемического гриппа и позволяет тем самым расширить перечень хорошо известных предикторов тяжести его течения в детском возрасте и повысить вероятность прогноза.

Рецензенты:

Шаповалов К.Г., д.м.н., доцент, заведующий кафедрой анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;

Малежик Л.П., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.

Работа поступила в редакцию 15.10.2014.