Вопрос о влиянии биогеохимических характеристик среды обитания на состояние здоровья человека, а именно на иммунный статус при микро- и макроэлементозах, остается недостаточно изученным [1].
Повышенный уровень содержания различных токсических веществ, в том числе микроэлементов, в выбросах и стоках промышленных предприятий приводит к их накоплению в окружающей среде и в организме человека и изменению реактивности организма [2, 3]. Между тем темпы развития антропогенных изменений биосферы значительно опережают адаптационные возможности организма человека [4, 5]. Так как реакции адаптации проявляются в первую очередь на уровне регуляторных систем: нервной, эндокринной, иммунной, системы неспецифической резистентности, Черешнев В.А. с соавт. считают, что антропогенные факторы вносят свой дополнительный вклад в раздражительную нагрузку и нередко приводят к срыву нормальных адаптационных процессов [6].
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования стало изучение влияния соединений тяжелых металлов на показатели клеточного звена иммунитета опытных и контрольных крыс.
Материал и методы исследования
В эксперимент взяты белые беспородные крысы-самцы массой тела 180–220 г, содержавшиеся в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями, изложенными в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и научных целях», Страсбург, 18 марта 1986 г. Получено решение локальной этической комиссии КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова о проведении экспериментальных работ (протокол № 2 от 18.04.2013 г.).
Проведены 2 серии эксперимента (по 26 крыс в каждой серии): 1 серия – половозрелые крысы (контроль); 2 серия – половозрелые крысы + соединения тяжелых металлов.
Затравку животных ванадатом аммония (ВА) и бихроматом калия (БК) проводили в течение двух недель из расчета по 5 мг/кг массы тела перорально при помощи металлического зонда. Контроль за состоянием животных проводили визуально (по состоянию кожных покровов, активности, массе тела, сохранению инстинктов и т.д.), оценку иммунного статуса проводили с помощью методик по определению в крови:
1) общего количества лейкоцитов, лейкоформулы (по общепринятой методике);
2) спонтанного и индуцированного НСТ теста (тест восстановления нитросинего тетразолия), спонтанного и индуцированного фагоцитоза [7];
3) общего количества лимфоцитов и их субпопуляций (CD3+, CD4+, CD8+) реакцией поверхностной иммунофлюоресценции с помощью набора неконъюгированных моноклональных антител фирмы CALTAG Laboratories.
Оценка первого уровня иммунного статуса проводилась в медицинском центре «Иммунодиагностика».
Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ «STATISTICA-7». На первом этапе рассчитывали групповые показатели суммарной статистики – среднюю арифметическую величину (M) и ошибку средней (m), а также проводили визуализацию распределения значений с помощью частотных гистограмм. Для выбора критерия оценки значимости парных различий проверяли соответствие формы распределения нормальному, используя критерий Шапиро ‒ Уилка. Учитывая, что этим условиям удовлетворяла лишь часть эмпирических распределений признаков, проверку гипотезы о равенстве генеральных средних во всех случаях проводили с помощью критерия Ван Дер Вардена для независимых переменных. Нулевую гипотезу отвергали в случае p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Двухнедельная затравка соединениями тяжелых металлов приводила к статистически значимому снижению общего количества лейкоцитов в крови у опытных крыс по сравнению с контролем на 40,2 % (р = 0,0007), что, по-видимому, происходило за счет статистически значимого снижения абсолютного содержания лимфоцитов в 2,2 раза (р < 0,0001) (табл. 1).
Таблица 1
Распределение средних показателей крови у крыс, затравленных соединениями тяжелых металлов, в сравнении с контролем
|
Показатели крови, (109 г/л) |
Контроль, (n = 26) |
Металлы, (n = 26) |
р*** |
||||
|
Mean/s*, % |
Mean/s, абс. |
КВ, % ** |
Mean/s, % |
Mean/s, абс. |
КВ, % |
||
|
Общих лейкоцитов |
– |
9,7/0,3 |
12,6 |
– |
5,8/0,6 |
18,1 |
0,0007 |
|
Лимфоцитов |
78,2/1,0 |
7,6/0,2 |
5,2 |
60,5/2,1 |
3,4/0,4 |
15,2 |
< 0,0001 |
|
Палочкоядерных |
1,7/0,2 |
0,2 |
38,8 |
2,5/0,5 |
0,1 |
19,2 |
0,1328 |
|
Сегментоядерных |
16,8/0,9 |
1,6 |
23,2 |
30,8/2,2 |
1,8 |
14,5 |
0,0001 |
|
Эозинофилов |
0,9/0,2 |
0,1 |
76,8 |
1,8/0,4 |
0,1 |
11,4 |
0,0645 |
|
Моноцитов |
2,4/0,2 |
0,2 |
43,4 |
4,5/0,4 |
0,3 |
16,7 |
0,0006 |
Примечания: * – М(СО) – среднее (стандартное отклонение); ** – коэффициент вариации; *** – по Van der Waerden Two-Sample Test уровень статистической значимости по отношению к контролю.
Коэффициент вариации обоих показателей крови был выше на 43,6 и 192,3 % соответственно по сравнению с контролем, что свидетельствовало о наибольшей изменчивости данных опытных крыс.
Результаты исследования иммунологических показателей крыс, подвергавшихся воздействию ВА и БК, приведены в табл. 2. Исследование функции нейтрофилов в индуцированном пирогеналом НСТ-тесте показало, что под влиянием ВА и БК последовало статистически значимое увеличение их метаболической активности на 9,1 % (р = 0,0291).
Вместе с тем статистически значимого повышения фагоцитарной активности нейтрофилов не последовало.
Анализ состояния клеточного звена иммунитета путём определения общего количества лимфоцитов и их субпопуляций (CD3+, CD4+, CD8+) показал, что в опытной серии эксперимента их уровень оказался статистически значимо ниже контрольных значений (р < 0,0001) (табл. 3).
С целью выявления связи между изучаемыми показателями иммунного статуса крыс группы «Хром + Ванадий» был проведен корреляционный анализ. Структура зависимости показателей иммунного статуса крыс, подвергавшихся воздействию ВА и БК, отражающая скрытую связь между изучаемыми переменными, представлена в корреляционной матрице (табл. 4).
Таблица 2
Распределение средних показателей спонтанной и индуцированной активности нейтрофилов в НСТ-тесте у крыс, затравленных соединениями тяжелых металлов, в сравнении с контролем
|
Показатель |
Контроль, n = 26 |
Shapiro-Wilk *** |
Хром + Ванадий, n = 26 |
Shapiro-Wilk |
р **** |
||||
|
M (СО)* |
95 % ДИ |
КВ** |
M (СО) |
95 % ДИ |
КВ |
||||
|
НСТ спонт., % |
16,6 (2,7) |
15,6–17,7 |
16,1 |
0,0485 |
18,0 (3,3) |
16,7–19,3 |
18,1 |
0,2684 |
0,1695 |
|
НСТ индуц., % |
36,3 (4,9) |
34,3–38,2 |
13,4 |
0,0035 |
39,6 (6,0) |
37,1–42,0 |
15,2 |
0,5197 |
0,0291 |
|
ФГ спонт., % |
15,3 (2,8) |
14,2–16,4 |
18,0 |
0,4528 |
17,0 (3,3) |
15,7–18,3 |
19,2 |
0,0138 |
0,0660 |
|
ФГ индуц., % |
35,3 (5,4) |
33,1–37,5 |
15,4 |
0,4287 |
38,3 (5,6) |
36,1–40,6 |
14,5 |
0,9852 |
0,0620 |
Примечания: * – М (СО) – среднее (стандартное отклонение); ** – коэффициент вариации; *** – нормальность распределения; **** – по Van der Waerden Two-Sample Test уровень статистической значимости по отношению к контролю.
Таблица 3
Распределение средних показателей CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов у крыс, затравленных соединениями тяжелых металлов, в сравнении с контролем
|
Показатель |
Контроль, n = 26 |
Shapiro-Wilk *** |
Хром + Ванадий, n = 26 |
Shapiro-Wilk |
р **** |
||||
|
M (СО)* |
95 % ДИ |
КВ** |
M (СО) |
95 % ДИ |
КВ |
||||
|
CD3+, абс. |
5,6 (0,8) |
5,2–6,0 |
13,9 |
0,0536 |
1,9 (0,8) |
1,4–2,4 |
40,6 |
0,0225 |
< 0,0001 |
|
CD3+, % |
73,8 (2,6) |
72,5–75,1 |
3,5 |
0,8038 |
55,2 (2,3) |
53,7–56,6 |
4,2 |
0,9885 |
< 0,0001 |
|
CD4+, абс. |
2,5 (0,5) |
2,3–2,8 |
19,5 |
0,0138 |
0,5 (0,2) |
0,4–0,7 |
41,8 |
0,0654 |
< 0,0001 |
|
CD4+, % |
44,5 (4,1) |
42,4–46,5 |
9,2 |
0,0048 |
28,1 (2,6) |
26,5–29,6 |
9,2 |
0,3232 |
< 0,0001 |
|
CD8+, абс. |
1,7 (0,3) |
1,5–1,8 |
15,9 |
0,2608 |
0,5 (0,2) |
0,4–0,6 |
42,0 |
0,2531 |
< 0,0001 |
|
CD8+, % |
29,8 (2,9) |
28,3–31,2 |
9,8 |
0,1831 |
26,6 (4,0) |
24,2–29,1 |
15,2 |
0,0044 |
0,0347 |
|
CD4+/CD8+ |
1,5 (0,3) |
1,4–1,6 |
18,6 |
0,0223 |
1,0 (0,3) |
0,8–1,2 |
19,3 |
0,0033 |
< 0,0001 |
Примечания: * – М (СО) – среднее (стандартное отклонение); ** – коэффициент вариации; *** – нормальность распределения; **** – по Van der Waerden Two-Sample Test уровень статистической значимости по отношению к контролю.
Таблица 4
Корреляционная матрица показателей иммунного статуса крыс, подвергавшихся воздействию соединений тяжелых металлов
|
Переменная |
ОЛ |
Л |
НСТс |
НСТи |
ФГс |
ФГи |
CD3+ |
CD4+ |
CD8+ |
|
Общих лейкоцитов (ОЛ) |
1,0 |
||||||||
|
Лимфоцитов (Л) |
0,81* |
1,0 |
|||||||
|
НСТ спонт. (НСТс) |
0,06 (0,554) |
0,10 (0,331) |
1,0 |
||||||
|
НСТ индуц. (НСТи) |
0,064 (0,554) |
0,06 (0,582) |
0,80* |
1,0 |
|||||
|
ФГ спонт. (ФГс) |
–0,02 (0,884) |
0,03 (0,785) |
0,85* |
0,70* |
1,0 |
||||
|
ФГ индуц. (ФГи) |
–0,02 (0,823) |
0,02 (0,818) |
0,79* |
0,80* |
0,84* |
1,0 |
|||
|
CD3+, абс. |
0,65* |
0,84* |
0,037 (0,755) |
0,03 (0,802) |
–0,03 (0,824) |
0,03 (0,791) |
1,0 |
||
|
CD4+, абс. |
0,62* |
0,81* |
0,033 (0,781) |
0,02 (0,875) |
–0,06 (0,644) |
0,0004 (0,998) |
0,97* |
1,0 |
|
|
CD8+, абс. |
0,54 (0,536) |
0,72* |
0,03 (0,812) |
0,001 (0,994) |
–0,02 (0,896) |
0,007 (0,954) |
0,93* |
0,86* |
1,0 |
Примечание. * – коэффициенты корреляции значимы при р < 0,0001, в скобках приведены достигнутые уровни значимости.
Максимальный уровень корреляции (0,90466, р < 0,001) в контрольной группе был достигнут между признаками «НСТ спонтанный» и «НСТ индуцированный», тогда как в группе «Хром + Ванадий» эта связь слабее (0,80029, р < 0,001).
Обнаружена положительная корреляционная связь между увеличением абсолютного содержания лимфоцитов и общего количества лейкоцитов (0,90197, р < 0,0001) в группе «Контроль», так же, как и сильная положительная корреляция между уменьшением абсолютного содержания лимфоцитов и общего количества лейкоцитов (0,81204, р < 0,0001) в группе «Хром + Ванадий».
Состояние хелперно-супрессорной активности CD4+, CD8 + субпопуляций Т-лимфоцитов положительно коррелировало с содержанием CD3 + лимфоцитов (r = 0,97; r = 0,93; р < 0,0001). Также уменьшение абсолютного содержания лимфоцитов приводило к уменьшению всех изучаемых субпопуляций лимфоцитов (r = 0,84 r = 0,81; r = 0,72; р < 0,0001).
Описываемая корреляционная матрица используется в качестве исходной информации для определения главных факторов (табл. 5). Основной задачей факторно-аналитического подхода, кроме сжатия информации, является физиологическая смысловая интерпретация данных. Значительно легче интерпретировать полученные факторы, использовав для получения простой структуры процедуру вращения факторов. В наших исследованиях используется «варимакс» вращение. Указанный аналитический метод приводит к еще большему увеличению больших и уменьшению малых нагрузок факторов.
Таблица 5
Факторная модель показателей иммунного статуса крыс, подвергавшихся воздействию ВА и БК (матрица факторных нагрузок после процедуры вращения «варимакс»)
|
Переменная |
Нагрузки для факторов |
|
|
Фактор 1 (F1) |
Фактор 2 (F2) |
|
|
НСТ спонт., % |
0,894250 |
–0,028274 |
|
НСТ индуц., % |
0,913055 |
–0,002645 |
|
ФГ спонт., % |
0,857319 |
–0,016029 |
|
ФГ индуц., % |
0,863014 |
0,002517 |
|
Общих лейкоцитов |
0,007111 |
0,136281 |
|
Лимфоцитов, % |
0,011983 |
0,941991 |
|
Сегментоядерных, % |
–0,011311 |
–0,945703 |
Из представленной таблицы видно, что в первом факторе 4 признака имеют большие нагрузки. Эти признаки характеризуют метаболическую и фагоцитарную активность нейтрофилов. Причем спонтанная метаболическая активность нейтрофилов в первом наиболее значимом компоненте с факторной нагрузкой +0,894 имеет сильную прямую ассоциацию с индуцированной (+0,913), а спонтанная фагоцитарная активность (+0,857) – среднюю прямую ассоциацию с индуцированной (+0,863). Второй фактор образовали признаки, характеризующие такие показатели крови, как процентное содержание лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов. Матрица повёрнутых компонентов показала, что процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов у крыс, затравленных соединениями тяжелых металлов, имеет отрицательную корреляционную зависимость (векторная нагрузка –0,946) от процентного содержания лимфоцитов (0,942). Из представленных в табл. 1 результатов исследования периферической крови видно, что относительное и абсолютное содержание лимфоцитов у крыс, затравленных ВА и БК, по сравнению с контролем снижалось на 22,6 и 55,3 % соответственно, тогда как относительное и абсолютное содержание сегментоядерных нейтрофилов повышалось на 83,3 и 12,5 % соответственно.
Заключение
На основании приведенных экспериментальных данных можно заключить, что под влиянием соединений ванадия и хрома снижаются метаболические и фагоцитарные функции нейтрофилов, хелперно-супрессорная активность лимфоцитов, а также общее содержание лейкоцитов периферической крови.
Благодарности. Автор выражает благодарность редактору Биометрики Леонову В.П. за помощь в проведении статистического анализа экспериментальных данных.
Рецензенты:
Пичхадзе Г.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии, КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы;
Шортанбаев А.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой иммунологии, КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы.
Работа поступила в редакцию 29.09.2014.