Основными видами диагностики вирусных инфекционных заболеваний, несмотря на разнообразие современных методов лабораторных исследований, остаются серологические тесты и классический метод выделения вирусов на культуре клеток. Успех своевременной этиологической диагностики хантавирусных инфекций в значительной степени зависит от разработки новых и совершенствования рутинных иммунологических методов исследования. Трудности, связанные с выделением на культуре клеток хантавирусов от больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) и грызунов-носителей, выдвигают на первое место серологические тесты. Для выявления специфических антител к определенному вирусу чаще всего используют метод непрямой иммунофлюоресценции (НМФА). К вирусам, обладающим гемагглютинирующими свойствами, применяют также и иммунологическую реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), которая основана на способности сывороточных антител, вырабатываемых к гемагглютининам (специфическим белкам, содержащимся во внешней оболочке некоторых вирусов), подавлять вызываемую вирусом агглютинацию эритроцитов. После успешной изоляции прототипного штамма 76-118 вируса Hantaan [8] рН-зависимые гемагглютинины были выявлены в антигенах, полученных из мозга новорожденных мышей, клеток VERO E-6, вируссодержащих культуральных жидкостей [6, 10, 11]. Чувствительность и специфичность тестов гемагглютинации в значительной степени зависит от источника и способа получения антигенов, при этом условия репродукции вирусов оказывают заметное влияние на формирование гемагглютининов, а воздействие физических и химических факторов влияет на функциональные свойства антигенов и их стабильность [1, 10]. Было отмечено [9], что тест РТГА по своей специфичности не уступает реакции нейтрализации с использованием тканевых культур, а его применение предпочтительнее в тех регионах, где одновременно циркулируют несколько антигенных вариантов хантавирусов. На территории Приморского края с помощью молекулярно-генетических методов исследования выявлена циркуляция трех патогенных хантавирусов – Hantaan (геновариант FE), Amur и Seoul (геновариант VDV), природными хозяевами для которых установлены восточный подвид полевой мыши (Apodemus agrarius), восточно-азиатская мышь (Apodemus peninsulae) и серая крыса (Rattus norvegicus) соответственно [3–5].
Цель работы – показать эффективность модифицированных тестов торможения гемагглютинации при идентификации штаммов близкородственных вирусов Amur и Hantaan (геновариант FE), изолированных от экологически разных видов мышей рода Apodemus – A. peninsulae и A. agrarius соответственно, а также случаев заболевания ГЛПС, обусловленных этими патогенами, на территории Приморского края.
Материал и методы исследования
Гемагглютинирующие антигены штаммов – прототипных и выделенных нами на клеточной культуре VERO E-6 от грызунов-носителей хантавирусов на территории края – готовили из вируссодержащих культуральных жидкостей по разработанному способу [2]. Исследовали сыворотки крови от инфицированных хантавирусом грызунов (n = 86) и больных ГЛПС (n = 246) из трех очаговых регионов края (I – Восточно-Маньчжурский холмисто-равнинный, II – Амуро-Уссурийский предгорно-лесной, III – Сихотэ-Алиньский горно-таежный [7]) и г. Владивостока. Все больные были с серологически подтвержденным в НМФА диагнозом ГЛПС без четкого различия в титрах антител к вирусам Hantaan, Amur и Seoul. Гемагглютинирующую активность антигенов определяли в реакции гемагглютинации (РГА). Этиологическую диагностику ГЛПС у больных из разных регионов края и в разные сроки заболевания проводили в условиях модифицированной постановки РТГА – 2 активные единицы антигена (АЕ), время контакта 15 минут и 2 часа при +4 °С. Антигенные связи штаммов хантавирусов изучали в предложенной кинетической постановке РТГА (КРТГА) – 4 АЕ антигена, время контакта 15 и 30 минут, 1, 2, 4 и 18 часов при + 4 °С (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика тестов гемагглютинации, используемых в работе
|
Реакции |
Характеристика реакций |
|
Реакция гемагглютинации (РГА) |
Определение гемагглютинирующей активности антигенов и их рабочей дозы – 4-8 АЕ |
|
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) |
Оценка специфической гемагглютининингибирующей активности антител (антигемагглютининов) в сыворотках крови больных ГЛПС по ? 4-кратной разнице в титре антител к антигенам гомо- и гетерологичных хантавирусов |
|
Кинетическая реакция торможения гемагглютинации (КРТГА) |
Проведение серологической идентификации штаммов хантавирусов с учетом кинетики взаимодействия антигемагглютининов иммунных сывороток крови, полученных к серотипам Hantaan (HTNV), Amur (AMRV), Seoul (SEOV) и Puumala (PUUV), с гомо- и гетерологичными гемагглютинирующими антигенами хантавирусов |
Внутри- и межтиповые антигенные отношения исследуемых штаммов хантавирусов оценивали в перекрестных КРТГА, при этом степень антигенного сходства или различия штаммов количественно определяли по рассчитанному в каждой реакции значению предложенного ранее показателя А [1].
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе изучали эффективность теста РТГА для дифференциальной диагностики хантавирусных инфекций среди разных видов – носителей хантавирусов. Часть результатов параллельного титрования сывороток крови от инфицированных животных с гемагглютинирующими антигенами разных хантавирусов представлена в табл. 2. Специфические антитела чаще выявляли к тому хантавирусу, для которого данный вид животного является основным хозяином. В ряде случаев отмечали перекрестные реакции с гетерологичными вирусами, но титр антител к гомологичному вирусу был выше.
Таблица 2
Идентификация хантавирусной инфекции у грызунов-носителей в РТГА
|
Вид грызуна Номер исследуемой сыворотки |
Гемагглютинирующий антиген хантавируса / грызун-носитель |
|||
|
HTNV (Apodemus agrarius) |
AMRV (A. peninsulae) |
HOKV (Myodes rufocanus) |
VLАV (Microtus fortis) |
|
|
Apodemus agrarius 9189 9400 9564 9735 10360 10385 11007 |
10 – 640* 20 160 160 40 160 160 40 |
< 10–40 < 10 10 40 < 10 40 40 10 |
< 10–40 < 10 10 20 < 10 10 40 < 10 |
< 10–10 < 10 20 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 |
|
Apodemus peninsulae 5303 6670 7036 8535 9473 10497 10544 10619 10977 11050 11660 |
< 10–40 10 < 10 20 10 40 40 40 10 20 < 10 < 10 |
10–320 40 40 160 80 160 320 160 80 80 40 20 |
< 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 |
< 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 |
|
Myodes rufocanus 11525 |
10 |
< 10 |
80 |
20 |
|
Microtus fortis 9469 |
< 10 |
< 10 |
10 |
40 |
Примечание.* – титр антигемагглютининов (гемагглютининингибирующих антител).
При исследовании сывороток крови от восточно-азиатских мышей из лесных ландшафтов края СГТ антител с антигеном штамма от A. peninsulae был в 2 раза выше по сравнению с антигеном штамма от A. agrarius – 4,6 log2 и 2,3 log2 соответственно. В то же время при титровании сывороток крови полевых мышей из степных и лесостепных ландшафтных зон было получено более высокое значение СГТ антител с антигеном штамма от A. agrarius, чем с антигеном штамма от A. peninsulae – 5,7 log2 и 3,2 log2 соответственно.
На следующем этапе изучалась диагностическая эффективность модифицированной постановки РТГА для дифференциации хантавирусных инфекций у больных из разных очаговых регионов в период высокой заболеваемости ГЛПС на территории края (табл. 3).
Таблица 3
Типирование хантавирусной инфекции у больных ГЛПС из разных очаговых регионов Приморского края в модифицированной РТГА
|
Эпидемиологический тип очагов ГЛПС Очаговый регион |
Обследовано больных ГЛПС |
Случаи ГЛПС, обусловленные вирусом * |
Случаи ГЛПС не идентифицированы ** |
||
|
Hantaan |
Amur |
Seoul |
|||
|
Сельский тип: I очаговый регион II и III регионы |
67 21 46 |
19 14 5 |
39 3 36 |
н/о н/о н/о |
9 4 5 |
|
Городской тип |
29 |
2 |
5 |
20 |
2 |
|
В целом по краю |
96 |
21 |
44 |
20 |
11 |
Примечания: * – идентификация хантавирусных инфекций по ? 4-кратной разнице в титрах гемагглютининингибирующих антител в сыворотках крови к гомологичному и гетерологичным хантавирусам; ** – < 4-кратная разница в титрах антител к используемым гемагглютинирующим антигенам хантавирусов; н/о – не определено. Очаговые регионы: I – Восточно-Манчжурский холмисто-равнинный; II – Амуро-Уссурийский предгорно-лесной; III – Сихотэ-Алинский горно-таежный.
Amur-вирусная инфекция составила 45,8 ± 5,1 % случаев заболевания (в основном, у жителей II и III очаговых регионов), Hantaan-вирусная инфекция – 21,9 ± 4,2 % случаев (большей частью у жителей I очагового региона), Seoul-вирусная инфекция – 20,8 ± 4,1 % случаев (у жителей г. Владивостока). В 11,5 ± 3,3 % случаев этиологический агент не был установлен. Важно отметить, что при типировании сывороток крови от больных ГЛПС из г. Владивостока, помимо преобладающей Seoul-вирусной инфекции (69,0 ± 8,6 %), были идентифицированы Amur- и Hantaan-вирусные инфекции (17,2 ± 7,0 и 6,9 ± 4,7 % соответственно).
Основной этап нашей работы был посвящен количественной оценке антигенных различий между штаммами близкородственных вирусов Amur и Hantaan (геновариант FE), выделенных от экологически разных видов A. peninsulae и A. agrarius соответственно, с помощью перекрестной кинетической РТГА (табл. 4).
Таблица 4
Результаты идентификации штаммов хантавирусов, изолированных от экологически разных видов мышей рода Apodemus, в кинетической РТГА
|
Гемагглютинирующие антигены штаммов хантавирусов |
Иммунные сыворотки к прототипным штаммам хантавирусов |
||
|
Hantaan 76-118 HTNV |
CG-1820 PUUV |
SR-11 SEOV |
|
|
Вирус Hantaan: штамм 76–118 штаммы от Apodemus agrarius |
1* 0,58–0,60 |
0,01 0,01 |
0,18 0,13–0,18 |
|
Вирус Puumala: штамм CG–1820 |
0,05 |
1* |
0,04 |
|
Вирус Seoul: штамм SR–11 |
0,2 |
0,01 |
1* |
|
Вирус Amur: штаммы от Apodemus peninsulae |
0,27–0,29 |
0,01 |
0,25–0,27 |
Примечания: * – значения показателя А: 1 – соответствует гомологичной связи, десятичная дробь – гетерологичной связи. Значения показателя А от 1 до 0,3 соответствуют внутритиповым антигенным различиям; значения показателя А меньше 0,3 – межтиповым
Значения показателя А для гемагглютинирующих антигенов штаммов вируса Hantaan (геновариант FE) в кинетических реакциях с иммунной сывороткой к прототипному штамму Hantaan 76–118 варьировали в узком диапазоне 0,58–0,6, свидетельствуя об антигенном сходстве штаммов от полевых мышей в пределах одного серотипа Hantaan. Антигены штаммов вируса Amur, изолированные от восточно-азиатских мышей, проявили выраженное межтиповое серологическое отличие со штаммом Hantaan 76–118, имея числовые значения показателя А меньше 0,3 (0,27–0,29), которые соответствуют антигенным отношениям разных серотипов. В кинетических реакциях с иммунной сывороткой к прототипному штамму вируса Seoul антигены штаммов от мышей рода Apodemus ингибировались в меньшей степени, имея значения показателя А, соответствующие межтиповым отношениям: у A. agrarius от 0,13 до 0,18, у A. peninsulae от 0,25 до 0,27. С иммунной сывороткой к прототипному штамму вируса Puumala серологической связи у Amur- и FE–подобных штаммов не выявлено. Таким образом, штаммы вируса Amur продемонстрировали межтиповые антигенные различия со штаммами близкородственных вирусов Hantaan и Seoul, показав в кинетической РТГА с иммунными сыворотками к прототипным штаммам этих вирусов выраженное серологическое отличие (А < 0,3).
На завершающем этапе показана возможность использования модифицированного теста торможения гемагглютинации при ранней дифференциальной диагностике ГЛПС, обусловленной близкородственными вирусами Hantaan и Amur (табл. 5). Парные сыворотки крови, взятые в периоды острого заболевания, ранней и поздней реконвалесценции, титровались с гемагглютинирующими антигенами хантавирусов разных серотипов. При этом эффективность теста при установлении этиологического агента была значительно выше в острый период болезни по сравнению с периодом поздней реконвалесценции.
Таблица 5
Эффективность постановки этиологического диагноза ГЛПС в разные периоды заболевания с помощью модифицированной РТГА
|
Периоды болезни Неделя от начала заболевания |
Сыворотки крови от больных ГЛПС |
||
|
обследовано N |
с ≥ 4-кратно превышающим титром антигемагглютининов к гомологичному вирусу |
||
|
n |
M + m (%) |
||
|
Острый период / 1–2 неделя |
102 |
89 |
87,2 ± 3,3 |
|
Период ранней реконвалесценции / 3 неделя |
96 |
70 |
72,9 ± 4,5 |
|
Период поздней реконвалесценции / 4–5 неделя |
48 |
18 |
37,5 ± 7,0 |
Многообразие хантавирусов – род Hantavirus в настоящее время в общей сложности включает более 40 видов, из которых 22 считаются патогенными для человека – вызывает большой интерес к изучению их антигенных связей. Как известно, критерием для типовой идентификации хантавирусов являются различия, установленные с помощью генетического и филогенетического анализов, или ? 4-кратная разница в титре антител с гомо- и гетерологичными вирусами в реакции нейтрализации. Существенным недостатком реакции нейтрализации являются трудоемкость и длительность получения результатов в связи с замедленной репликацией хантавирусов; в обычной постановке РТГА довольно трудно установить различия между штаммами хантавирусов, имеющих близкие генетические связи между собой. Более высокая специфичность кинетической РТГА, по сравнению с РТГА, проявилась при изучении антигенных взаимосвязей близкородственных хантавирусов. Использование кинетической РТГА позволило выявить межтиповые антигенные различия между вирусами Amur и Hantaan (геновариант FE). Значительные отличия вируса Amur от других хантавирусов, выявленные на геномном уровне [12], дают основание предположить, что учет кинетики взаимодействия антител иммунных сывороток с гомо- и гетерологичными гемагглютинирующими антигенами позволяет в определенной степени оценивать различия в генных продуктах М-сегмента – оболочечных гликопротеинах Gn и Gc (ранее G1 и G2, которые менее консервативны, чем нуклеокапсидный белок N. Данные типирования сывороток от больных ГЛПС тестами торможения гемагглютинации подтвердили эпидемиологическую значимость трех вирусов – Amur, Hantaan (геновариант FE) и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края, согласуясь с результатами молекулярно-генетических исследований образцов РНК из крови больных ГЛПС и органов инфицированных диких животных [3, 4].
Заключение
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали эффективность применения модифицированных тестов торможения гемагглютинации при изучении и идентификации близкородственных хантавирусов и вызываемых ими инфекций. Количественная оценка серологических связей штаммов хантавирусов в кинетической постановке РТГА выявила межтиповые антигенные отличия вируса Amur от серотипов Hantaan, Seoul и Puumala, указывая на самостоятельность вируса Amur в качестве отдельного серотипа в роду Hantavirus. Подтверждена эпидемиологическая значимость трех серотипов хантавирусов – Amur, Hantaan и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края. Возможность проведения ранней этиологической серодиагностики ГЛПС имеет большое практическое значение при выборе тактики ведения и лечения больных, а также научном планировании и организации противоэпидемических мероприятий на эндемичных территориях с природными очагами циркуляции нескольких патогенных хантавирусов.
Рецензенты:
Коршукова О.А., д.м.н., профессор, руководитель научного отдела, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владивосток;
Зайцева Е.А., д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 06.10.2014.