Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

Personal portfolio

MOLECULAR KARYOTYPING: DIAGNOSTIC PROBLEMS OF MONOGENIC SYNDROMES WITHOUT DETECTABLE MUTATIONS ACCORDING TO DATA ON AUTISTIC DISORDERS (RETT SYNDROME)

Vorsanova S.G. 1, 2, 3 Iourov I.Y. 1, 2, 4 Kurinnaya O.S. 1, 2, 3 Voinova V.Y. 1, 2, 3 Demidova I.A. 1, 2, 3 Yurov Y.B. 1, 2, 3
1 Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov
2 Mental Health Research Center
3 Moscow State University of Psychology and Education
4 Russian Medical Academy of Postgraduate Education
Currently, patients with recognizable patterns of malformations featuring a monogenic syndrome frequently demonstrate the lack of single gene mutations. An example of similar situation is an autistic disorder known as Rett syndrome (RTT). RTT is the commonest genetic syndrome associated with autism and mental retardation in girls. The disease is caused by mutations in MECP2 gene. However, there are numerous cases demonstrating the lack of MECP2 mutations. Using modern techniques of molecular karyotyping it is possible to define genetic etiology of the disease. Here, a survey of chromosomal microaberrations and copy DNA number variations in RTT girls negative for MECP2 mutations was performed. By molecular karyotyping using DNA-microchips (array CGH) molecular cytogenetic analysis of 33 girls with clinical manifestations of RTT without point MECP2 mutations was performed. Ten cases demonstrated abnormal molecular karyotypes. Five girls had deletions in the X chromosome loci (Xq28) encompassing MECP2. These girls were characterized by a specific subtype of RTT clinically milder than classic RTT. An atypical RTT case was featured with genomic abnormalities affecting CDKL5 gene and critical regions of Prader-Willi/Angelman syndromes (15q12.2). Additionally, genomic variations were detected in in following chromosomal loci 3p13, 3q27.1 (in each single case) and 1q21.1-1q21.2 (2 cases). It is suggested that these genomic loci can encompass gene etiologically related to RTT phenotype. Other 23 cases were not hallmarked with pathogenic genome changes. According to our data, non-detected gene mutation is not an exclusion criterion for RTT. To avoid misdiagnosis of RTT, one has to use a complex workflow of genetic diagnosis, in which molecular cytogenetic techniques (array CGH or molecular karyotyping) are mandatory.
Rett syndrome
autistic disorders
DNA-microchips
molecular karyotyping
genomic and chromosomal abnormalities
1. Vorsanova S.G., Jurov I.Ju., Voinova V.Ju., Kurinnaja O.S., Zelenova M.A. ,Demidova I.A., Ulas E.I., Jurov Ju.B. Mikrodelecionnye formy sindroma Retta, vyjavlennye metodom molekuljarnogo kariotipirovanija na DNK-mikromatricah (array CGH), u devochek bez mutacij v gene MECP2. Zhurnal nevrologii i psihiatrii imeniS.S. Korsakova. 2013; 10: 47–52.
2. Vorsanova S.G., Jurov Ju.B., Sil’vanovich A.P., Demidova I.A., Jurov I.Ju. Sovremennye predstavlenija o molekuljarnoj genetike i genomike autizma. Fundamental’nye Issledovanija. 2013; 4 (2): 356–67
3. Amir R.E., Van den Veyver I.B., Wan M., Tran C.Q., Francke U., Zoghbi H.Y. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2, Nat. Genet. 1999; 23: 185–8.
4. Archer H.L., Whatley S.D., Evans J.C., Ravine D., Huppke P., Kerr A., Bunyan D., Kerr B., Sweeney E., Davies S.J., Reardon W., Horn J., MacDermot K.D., Smith R.A., Magee A., Donaldson A., Crow Y., Hermon G., Miedzybrodzka Z., Cooper D.N., Lazarou L., Butler R., Sampson J., Pilz D.T., Laccone F., Clarke A.J. Gross rearrangements of the MECP2 gene are found in both classical and atypical Rett syndrome patients, J. Med. Genet. 2006; 43: 451–6.
5. Bebbington A., Downs J., Percy A., Pineda M., Zeev B.B., Bahi-Buisson N., Leonard H. The phenotype associated with a large deletion on MECP2, Eur. J. Hum. Genet. 2012; 20: 921–7.
6. Bourdon V., Philippe C., Labrune O., Amsallem D., Arnould C., Jonveaux P. A Detailed analysis of the MECP2 gene: prevalence of recurrent mutations and gross DNA rearrangements in Rett syndrome patients, Hum. Genet. 2001; 108: 43–50.
7. Chahrour M., Zoghbi H.Y. The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology, Neuron 2007; 56: 422–37.
8. Dragich J., Houwink-Manville I., Schanen C. Rett syndrome: a surprising result of mutation in MECP2, Hum. Mol. Genet. 2000; 9: 2365–75.
9. Florian C., Bahi-Buisson N., Bienvenu T. FOXG1-Related Disorders: From Clinical Description to Molecular Genetics, Mol. Syndromol. 2012; 2 (3–5): 153–63.
10. Hardwick S.A., Reuter K., Williamson S., Vasudevan V., Donald J., Slater K., Bennetts B., Bebbington A., Leonard H., Williams S.R., Smith R.L., Cloosterman D., Christodoulou J. Delineation of large deletions of the MECP2 gene in Rett syndrome patients, including a familial case with a male proband, Eur. J. Hum. Genet. 2007; 1 5 (12): 1218–29.
11. Horn D. Mild to moderate intellectual disability and significant speech and language deficits in patients with FOXP1 deletions and mutations, Mol. Syndromol. 2012; 2 (3–5): 213–6.
12. Iourov I.Y., Vorsanova S.G., Voinova V.Y., Kurinnaia O.S., Zelenova M.A., Demidova I.A., Yurov Y.B. Molecular karyiotyping by array CGH in a Russian cohort of children with intellectual disability, autism, epilepsy, and congenital anomalies, Mol. Cytogenet. 2012; 5: 46.
13. Kobayashi Y., Ohashi T., Akasaka N., Tohyama J. Congenital variant of Rett syndrome due to an intragenic large deletion in MECP2, Brain Dev. 2012; 34: 601–604.
14. Matsuishi T., Yamashita Y., Takahashi T., Nagamitsu S. Rett syndrome: the state of clinical and basic research, and future perspectives, Brain Dev. 2011; 33: 627–31.
15. Neul J.L., Kaufmann W.E., Glaze D.G., Christodoulou J., Clarke A.J., Bahi-Buisson N., Leonard H., Bailey M.E., Schanen N.C., Zappella M., Renieri A., Huppke P., Percy A.K. Rett Search Consortium: Rett syndrome: revised diagnostic criteria and nomenclature, Ann. Neurol. 2010; 68: 944–50.
16. Ravn K., Nielsen J.B., Skjeldal O.H., Kerr A., Hulten M., Schwartz M. Large genomic rearrangements in MECP2, Hum. Mutat. 2005; 25: 324.
17. Scala E., Longo I., Ottimo F. MECP2 deletions and genotype-phenotype correlation in Rett syndrome, Am. J. Med. Genet. 2007; 143A (23): 2775–84.
18. Smeets E.E., Pelc K., Dan. B. Rett Syndrome, Mol. Syndromol. 2012; 2 (3–5): 113–27.
19. Temudo T., Santos M., Ramos E., Dias K., Vieira J.P., Moreira A., Calado E., Carrilho I., Oliveira G., Levy A., Barbot C., Fonseca M., Cabral A., Cabral P., Monteiro J., Borges L., Gomes R., Mira G., Pereira S.A., Santos M., Fernandes A., Epplen J.T., Sequeiros J., Maciel P. Rett syndrome with and without detected MECP2 mutations: an attempt to redefine phenotypes, Brain Dev. 2011; 33: 69–76.
20. Vorsanova S.G., Demidova I.A., Ulas V.Y., Soloviev I.V., Kazantzeva L.Z., Yurov Y.B. Cytogenetic and molecular-cytogenetic investigation of Rett syndrome. Analysis of 31 cases, NeuroReport. 1996; 7: 187–9.
21. Vorsanova S.G., Iourov I.Y., Yurov Y.B. Neurological, genetic and epigenetic features of Rett syndrome, J. Pediatr. Neurol. 2004; 2 (4): 179–90.
22. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Soloviev I.V., Iourov I.Y. Molecular cytogenetic diagnosis and somatic genome variations, Curr. Genomics. 2010; 11 (6): 440–6.
23. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Ulas V.Y., Demidova I.A., Sharonin V.O., Kolotii A.D., Gorbatchevskaia N.L., Beresheva A.K., Soloviev I.V. Cytogenetic and molecular cytogenetic studies of Rett syndrome (RTT): a retrospective analysis of a Russian cohort of RTT patients (the investigation of 57 girls and three boys), Brain Dev. 2001; 23 (S.1): 196–201.
24. Weaving L.S., Ellaway C.J., Gécz J., Christodoulou J. Rett syndrome: clinical review and genetic update, J. Med. Genet. 2005; 42: 1–7.
25. Weng S.M., Bailey M.E., Cobb S.R. Rett syndrome: from bed to bench, Pediatr. Neonatol. 2011; 52 (6): 309–16.

Одним из синдромов аутистических расстройств является синдром Ретта (RTT). RTT (OMIM 312750) – орфанное психическое заболевание (частота: 1:10000–1:15000), связанное с нарушением развития ЦНС. В настоящее время RTT рассматривается как самый распространенный и социально значимый генетический синдром, приводящий к аутизму и умственной отсталости у девочек [7, 14, 21, 24]. Этиология заболевания связана с мутациями в гене MЕCP2, расположенном на длинном плече хромосомы X в участке Xq28 и кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2 (MECP2) [3, 8]. Этот белок играет ключевую роль в эпигенетической регуляции активности генов ЦНС. Мутации гена MЕCP2 выявляются у большинства (до 90 %) индивидуумов c клиническими признаками классической формы RTT и до 60 % у индивидуумов с атипичной клинической картиной данного синдрома [2, 14, 15, 17, 18, 20, 23].

В литературе описано большое число случаев заболевания, при которых отмечается отсутствие мутаций гена MЕCP2, несмотря на полное соответствие диагностическим критериям RTT [11, 15, 19]. Помимо гена MЕCP2, у индивидуумов с атипичными формами RTT выявлены мутации и в других генах. Среди них – мутации в гене FOXG1 (forkhead boxprotein G1), картированном в участке 14q12, а также мутации гена CDKL5 (cycline-dependentkinase-like 5) в участке Xp22.13, кодирующего одноименный ядерный белок, который экспрессируется в клетках ЦНС и предположительно участвует в тех же внутриклеточных процессах, что и MECP2 [3, 9, 11]. Мутации гена CDKL5 находят у 28 % больных девочек [18, 25]. Эпигенетические изменения, проявляющиеся в виде специфического характера репликации ДНК хромосомы Х и наблюдаемые при RTT, свидетельствуют о действии характерного для этого заболевания патогенетического механизма как при наличии мутаций гена MЕCP2, так и при их отсутствии [15, 23]. Описано несколько случаев субмикроскопических делеций в участке Xq28, затрагивающих ген МЕСР2, у детей с фенотипическими проявлениями классической и атипичной форм RTT [6, 10, 16]. Субмикроскопические вариации числа копий последовательностей ДНК (делеции/дупликации), затрагивающие целиком ген МЕСР2, невозможно обнаружить только с использованием молекулярно-генетических методов для выявления внутригенных мутаций [1, 4, 5, 12, 13, 22].

В данной работе был осуществлён поиск структурных микроаномалий и вариаций числа копий ДНК генома, которые этиологически и патогенетически могут быть связаны с RTT, при использовании технологии молекулярного кариотипирования.

Материалы и методы исследования

Обследованы 33 девочки с RTT, у которых не обнаружено мутаций гена MECP2, но клинические проявления соответствовали критериям различных форм RTT. Для молекулярного кариотипирования (полногеномного сканирования) была использована серийная сравнительная геномная гибридизация на ДНК-микрочипах (array CGH) [12, 19. 22], содержащих 135 тыс. олигонуклеотидных проб, позволяющих сканировать геном с разрешением ≤ 20 000 пн. Патогенность обнаруженных вариаций генома оценивали с использованием оригинальной биоинформатической технологии. Для выявления субмикроскопических изменений последовательности ДНК < 100 000 пн был специально разработан алгоритм обработки данных соотношения интенсивности гибридизационных сигналов проб донора и пациента.

Результаты исследования и их обсуждение

После проведённых исследований в 10 из 33 случаев (30,3 %) обнаружены какие-либо нарушения в геноме. Все эти случаи представлены ниже.

Случай 1. При исследовании 17-летней девушки с клинически классической формой RTT, у которой методом секвенирования не были выявлены мутации в гене МЕСР2, обнаружены делеция в участке Xq28, затрагивающая этот ген, а также дупликация 2 генов в участке 15q14, ассоциированных с сердечно-сосудистыми нарушениями. Согласно полученным нами данным, диагноз RTT подтвержден с помощью молекулярного кариотипирования, несмотря на отрицательные результаты молекулярно-генетического анализа. В данном наблюдении при молекулярно-цитогенетическом анализе нами выявлены также особенности репликации хромосомы Х (эпигенетический фактор), характерные для RTT [20, 23].

Случай 2. Анализ методом array CGH выявил у девочки 6 лет со стертой формой заболевания делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2, подтвердив молекулярным кариотипированием ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз. Кроме того, была выявлена дупликация гена FANCF, являющаяся фактором риска возникновения онкологических заболеваний.

Случай 3. Исследование девочки 8 лет, у которой наблюдался RTT с поздним регрессом, выявило делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2. Выявлена также дупликация в участке 22q11.21, затронувшая 9 генов, из которых 6 вовлечены в 18 геномных сетей внутриклеточных процессов регуляции гомеостаза.

Случай 4. У девочки 4 лет со стертой формой заболевания выявлена делеция в участке Xq28, затрагивающая ген МЕСР2, подтвердив ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз. Кроме того, выявлена трипликация участка 2q13, затрагивающая 3 гена, которые играют значительную роль в регуляции критических внутриклеточных процессов.

Случай 5. У девочки 9 лет с классической формой RTT также подтвердился молекулярным кариотипированием ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз, как и в предыдущих 4 наблюдениях, поскольку была выявлена делеция в участке Xq28, затрагивающая ген МЕСР2. Таким образом, основываясь на представленных 5 случаях, можно сделать вывод о том, что существуют обуславливающие RTT рекуррентные делеции в данном локусе хромосомы Х.

Ниже приводим также описания и тех редких случаев, в которых наблюдался RTT-подобный фенотип, но не были выявлены изменения генома, затрагивающие участок Xq28.

Случай 6. У ребенка 8 лет с RTT-подобным фенотипом методом array CGH обнаружена делеция 3р13, приведшая к потере 2–5 экзонов (в зависимости от изоформы) гена FOXP1, мутации которого связаны с аутизмом, умственной отсталостью и нарушением речи. Похожие случаи (делеции меньшего размера) описаны в литературе, однако RTT-подобный фенотип при таких формах вариации генома не выявлен. Следует отметить, что в данном случае клиническая картина RTT была менее явной, чем в ранее приведенных описаниях. У девочки также была обнаружена дупликация участка 6q22.31 (7 генов) с отрицательным влиянием на функционирование головного мозга в пре- и постнатальном периодах.

Случай 7. У девочки в возрасте 5 лет наблюдались микробрахицефалия, микроаномалии развития (выступающая увеличенная нижняя челюсть, большой рот), симптоматическая эпилепсия с конца первого года жизни, разнообразные стереотипные движения и сохранные целенаправленные движения рук. Клинический диагноз представлен как атипичная форма RTT с ранним началом судорог. Методом array CGH были обнаружены соматический мозаицизм по делеции в критическом участке микроделеционных синдромов Прадера – Вилли и Ангельмана (15q11.2), делеция 2-х экзонов (2-го и 3-го) гена CDKL5 (размер: 18463 пн), а также делеция в участке 11p13 с отрицательным воздействием на функционирование головного мозга в пре- и постнатальном периодах. Таким образом, данный случай был классифицирован как «атипичная форма RTT», связанная с интрагенной делецией CDKL5 и мозаицизмом по делеции del(15)(q11.2). Примечательно, что подобные клинические проявления характерны как для синдрома Ангельмана (аутистические расстройства), так и для атипичной формы RTT, связанной с мутациями в гене CDKL5 [18, 25].

Случай 8. С помощью молекулярного кариотипирования у девочки 8 лет с тяжелой формой RTT была обнаружена делеция в участке 3q27.1 (размер: 248602 пн), затронувшая 13 генов, из которых 7 (HTR3D, HTR3C, HTR3E, EIF2B5, DVL3, AP2M1 и ABCC5) связаны с регуляцией различных молекулярных и клеточных процессов в тканях головного мозга. Эта делеция обнаружена впервые нами.

Случаи 9 и 10. При RTT фенотипе у двух неродственных девочек метод array CGH позволил выявить дупликацию в хромосомном локусе 1q21.1-1q21.2. У одной девочки отмечены геномная локализация: 146111761–148043201, размер: 1931441 пн, дупликация 60 генов, из которых 12 индексированы в OMIM, а у другой – геномная локализация: 145933030–148105148, размер: 2172119 пн, дупликация 70 генов, из которых 13 индексированы в OMIM. Делеции и дупликации в этом хромосомном участке являются причиной различных форм нарушения психики и врожденных пороков развития у детей [1, 2]. Тем не менее RTT-подобный фенотип при них ранее не отмечался. Следовательно, данное наблюдение представляет собой случай впервые описанной дупликации 1q21.1-q21.2 c клиническими проявлениями RTT и множественными микроаномалиями развития. Следует отметить, что подобные случаи выявляются только с помощью молекулярного кариотипирования (технологии array CGH).

У 23 девочек с классической формой RTT из 33 исследованных методом array CGH не выявлены вариации числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением. В данных случаях нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга, требующие дополнительных молекулярно-генетических и биоинформатических исследований.

Как отмечалось выше, методы прямого секвенирования гена MECP2 позволяют выявить точковые мутации примерно до 90 % больных с классической картиной и до 60 % – с атипичной картиной RTT [2, 3, 8, 14, 15, 17, 18, 20, 23]. Молекулярные причины болезни остаются неизвестными у 10–20 % больных с классическими и у 40 % – с атипичными формами RTT. Анализ полученных нами данных свидетельствует о том, что у обследованных больных выявляются микроделеции в участке q28 хромосомы Х, захватывающие в основном целиком ген MECP2, а также прилегающие к нему последовательности ДНК за границами этого гена. В ходе проведенного молекулярно-цитогенетического исследования были подтверждены ранее опровергнутые молекулярно-генетическими методами клинические диагнозы RTT у девочек с геномными делециями в участке Xq28. При этом у девочек с клиническим диагнозом RTT и полными делециями гена MECP2 наблюдается особый подтип заболевания, проявляющийся в виде клинически более легких, чем при классическом варианте, форм болезни.

Заключение

В проведенной нами работе с использованиием технологии молекулярного кариотипирования (array CGH) показано, что геномные делеции (хромосомные микроделеции), охватывающие участок хромосомы Х в области гена MECP2 (участок Xq28) и приводящие к полной делеции гена, этиологически и патогенетически могут быть связаны с RTT. Кроме того, использование технологии молекулярного кариотипирования позволило нам выявить другие, ранее неизвестные локусы, вовлеченные в этиологию аутизма и умственной отсталости у девочек с RTT фенотипом.

Таким образом, отрицательный результат молекулярно-генетического анализа мутаций гена MECP2 у девочек с клиническими проявлениями RTT (умственная отсталость различной степени тяжести, расстройства аутистического спектра и эпилепсия) не являются исключающим диагностическим критерием для клинического диагноза данного синдрома. Во избежание ошибок при лабораторной диагностике такого клинически и генетически гетерогенного заболевания, связанного с аутистическими расстройствами, как RTT, необходимо комплексное использование различных молекулярно-генетических и постгеномных технологий, включая молекулярное кариотипирование (array CGH).

Исследование выполнено за счет гранта Российского Научного Фонда (проект № 14-35-00060).

Работа поступила в редакцию 06.10.2014.