Анализ многочисленных литературных источников [1; 2; 4; 8] свидетельствуют о высоком интересе к проблеме криптоспоридиоза. Криптоспоридиоз – протозойная инвазия человека и животных, особенно опасная для молодняка сельскохозяйственных животных с иммунодефицитом. Инфекции желудочно-кишечного тракта, вызванные криптоспоридиями, зарегистрированы во всех регионах РФ и странах СНГ, а также на всех континентах, за исключением Антарктиды. Такое широкое распространение инвазии связано с большим количеством ее природных и синантропных резервуаров, низкой инфицирующей дозой и высокой резистентностью возбудителя к дезинфектантам и противопаразитарным препаратам. Криптоспоридии паразитируют преимущественно в кишечном тракте, но были обнаружены также в других органах, тканях и жидкостях (рвотные массы, мокрота, бронхиальная слизь).
Роль криптоспоридий в этиологии заболеваний животных в настоящее время установлена, но мало изучена [3]. Основные гистологические изменения наблюдаются в кишечнике больных животных. На слизистой оболочке отмечаются деформация ворсинок, единичные клетки слущенного эпителия, лимфоциты, гистиоциты и плазматические клетки. Криптоспоридии локализуются в просвете ворсинок, на их верхушках и боковых поверхностях, в микроворсинках эпителиального слоя тощей, подвздошной и в криптах слепой кишок [5; 6; 7]. В результате поражения микроворсинок нарушается всасывание питательных веществ, воды и электролитов, существенно страдает ферментативная деятельность кишечника.
Однако до сих пор криптоспоридиоз в ветеринарной практике почти не диагностируется и не указывается в ветеринарных отчетах. Причиной этого является неподготовленность ветеринарных специалистов и трудность диагностики ввиду микроскопического размера паразитов и частого участия в этиологии болезни наряду с другими патогенами.
Для диагностики криптоспоридиоза в настоящее время используются следующие методы: метод прямой микроскопии фекалий больных животных, окраска ооцист криптоспоридий в мазках фекалий или содержимого кишечника методом Циля – Нильсена, Романовского – Гимзы и по Граму, а также метод полимеразной цепной реакции – ПЦР. Основным методом, применяемым на практике, является паразитологический, заключающийся в обнаружении возбудителя при микроскопии материала. Как правило, криптоспоридии ищут в свежих фекалиях, из которых готовят тонкие мазки на предметных стеклах в 1–2 каплях изотонического раствора NaCl. Мазки сушат на воздухе не менее 30 мин, фиксируют смесью Никифорова 10–15 мин и снова сушат на воздухе. В дальнейшем их окрашивают различными красителями. Чаще применяют окрашивание карбол-фуксином по Цилю – Нильсену с последующим докрашиванием препаратов малахитовым зеленым. При этом ооцисты криптоспоридий приобретают ярко-красный цвет. Они имеют вид округлых образований диаметром до 5 мкм, внутри некоторых из них видны удлиненные спорозоиты. Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленый цвет. Капли жироподобных веществ и глыбки детрита также окрашиваются в ярко-красный цвет, но они не имеют четких контуров и какой-либо внутренней структуры.
Необходимо провести дифференциальную диагностику. Оценка делается по показателям, предложенным M. Bulgin (1983), после окраски по Граму.
- В поле зрения микроскопа почти чистая культура грамотрицательных мелких, толстых, с закругленными концами палочек, расположенных кучками. Ориентировочный диагноз – кишечная колиинфекция.
- В мазках-отпечатках преобладают грамположительные толстые, с прямоугольными концами бациллы, расположенные одиночно, парами или короткими цепочками. Ориентировочный диагноз – энтеротоксемия.
- При микроскопии мазков в поле зрения преобладают нейтрофильные клетки с микробами. Ориентировочный диагноз – сальмонеллез.
- В мазках имеются не окрашенные по Граму образования, по величине и форме напоминающие эритроциты, часть их имеет светлый ободок. Ориентировочный диагноз – криптоспоридиоз.
- В мазках-отпечатках содержится разнообразная микрофлора, среди которой трудно определить преобладающую. Такая картина характерна для инфекций, вызванных вирусами. Окончательно наличие эшерихиозных возбудителей определяется исследованиями патологического материала, предусмотренными методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза животных.
Для увеличения концентрации ооцист в исследуемом материале используют различные методы обогащения, чаще всего флотацию и седиментацию, так как нередко количество ооцист в фекалиях больных животных может быть настолько незначительным, что их выявление с помощью микроскопии окрашенных мазков представляет трудную задачу. В связи с этим используют методы обогащения, хорошо известные в гельминтологии. Флотационными жидкостями являются насыщенные растворы разных веществ. В качестве вспомогательного средства применяют флотацию без центрифугирования, флотацию с центрифугированием, методом седиментации.
В качестве флотационных жидкостей используют насыщенные растворы хлорида натрия (плотность раствора составляет 1,20 мг/см3), нитрата аммония (1,31 мг/см3), сахарозы (1,25 мг/см3), сульфата цинка (1,39 мг/см3), жидкость Дарлинга (1,20 мг/см3), среду Бреза (смесь насыщенных растворов сульфата магния, тиосульфата натрия и водопроводной воды в соотношении 3:3:1), смесь Павласека (хлорид цинка – 220 г, хлорид натрия – 210 г, водопроводная вода – 800 мл) и некоторые другие солевые растворы.
В последующем во избежание потерь собранных ооцист в процессе высушивания мазка и последующей его обработки рекомендуется предварительно нанести на покровное стекло небольшое количество плазмы или альбумина и высушить при комнатной температуре или в термостате при 37 °С.
Для длительного сохранения ооцист используют 2,5 % раствор бихромата калия. Через несколько дней вследствие исчезновения остаточного тела спорозоиты внутри ооцист видны более отчетливо. Материал можно хранить как при комнатной температуре, так и в холодильнике, но последнее предпочтительнее.
Перед заражением экспериментальных животных обязательно нужно проводить биопробу на мышах. Для постановки биопроб необходимо скормить небольшие порции фекалий новорожденным или 2–5-дневным белым мышам. При наличии в пробах ооцист криптоспоридий в фекалиях мышей через 5–8 дней будут обнаруживаться ооцисты. При вскрытии мышей в более ранний период (на 3–7-й день) в гистологических препаратах кишечника (предпочтительно использовать препараты подвздошной кишки) будут выявляться эндогенные стадии развития криптоспоридий, локализующихся в зоне щеточной каемки.
При постановке биопроб на животных можно к гомогенату фекалий добавлять антибиотики (пенициллин, стрептомицин, гентамицин), которые подавляют сопутствующую микрофлору, но не влияют на инвазивность ооцист криптоспоридий.
Количество ооцист криптоспоридий подсчитывают с помощью камеры Горяева, используемой в гематологической практике. После инкубации, стимулирующей эксцистирование ооцист, можно таким же способом подсчитывать и количество паразитов. Для количественной оценки можно также подсчитывать общее количество ооцист в окрашенном мазке, приготовленном из определенного количества фекалий (например, из 0,2 г).
Выводы
Согласно литературным данным и результатам собственных исследований, для выявления ооцист криптоспоридий наиболее приемлемым, особенно в условиях производства, является окраска мазков методом Циля – Нильсена. Для получения большой массы ооцист криптоспоридий следует использовать метод флотации с насыщенным раствором сахарозы. Культуру в последующем можно использовать при проведении экспериментальных исследований, а также для постановки биопроб на животных.
Рецензенты:
Столяров В.А., д.в.н., профессор кафедры морфологии и физиологии животных, Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, г. Саранск;
Ерофеев В.И., д.б.н., проректор института ФГОУ ДПОС «Мордовский институт переподготовки кадров агробизнеса», профессор кафедры научно-технического прогресса и организации производства, г. Саранск.
Работа поступила в редакцию 29.09.2014.