В России в структуре заболеваемости гемобластозами доминируют лимфопролиферативные новообразования, в том числе неходжкинские лимфомы (29,8 %) и хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) (15,3 %). Одним из ключевых моментов патогенеза лимфопролиферативных заболеваний является изменение продукции цитокинов. Роль большинства цитокинов при ХЛЛ и неходжкинских лимфомах из малых лимфоцитов достаточно хорошо изучена [2, 4, 10]. Состояние же цитокиновой системы в динамике химиотерапии остаётся недостаточно исследованным и в первую очередь это касается колониестимулирующих факторов.
Основная часть опубликованных результатов связана с изучением сывороточной концентрации цитокинов, отражающей общую иммунологическую реактивность организма. Исследования, посвящённые способности клеток крови к секреции цитокинов при ХЛЛ и неходжкинских лимфомах с опухолевым поражением костного мозга (НХЛ из малых лимфоцитов) ex vivo, немногочисленны. В одной из таких работ [1] показаны особенности спонтанной и митогениндуцированной продукции цитокинов при лимфопролиферативных заболеваниях в целом. При этом количество пациентов, включенных в исследование, с ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов оказалось небольшим, что не позволило сделать выводы о специфичности цитокинового баланса относительно этой группы больных. Таким образом, необходимо подтверждение полученных закономерностей на большей группе испытуемых.
Цель исследования – изучение уровня спонтанной и митогениндуцированной продукции про-, противовоспалительных цитокинов и колониестимулирующих факторов при ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов в динамике химиотерапии.
Материалы и методы исследования
Обследован 41 пациент с лимфопролиферативными заболеваниями (ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов), из них 29 мужчин и 12 женщин (средний возраст 54,90 ± 1,70 лет), находившихся на лечении в гематологическом отделении с блоком асептических палат ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница» в 2011–2014 гг. Пациенты с ХЛЛ имели В или С стадию по Binet, у всех пациентов с НХЛ из малых лимфоцитов отмечалось опухолевое поражение костного мозга и IV стадия. Диагноз НХЛ из малых лимфоцитов формулировали в соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2008, диагноз ХЛЛ определялся по Binet [6] и в соответствии с руководством Hallek [7]. Стадирование НХЛ из малых лимфоцитов осуществляли в соответствии с критериями классификации Ann Arbor в модификации Costwolds. Стадию ХЛЛ устанавливали по Binet [6]. Эффективность лечения при НХЛ из малых лимфоцитов оценивали согласно Российским клиническим рекомендациям по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний под руководством профессора И.В. Поддубной, 2013 г. Оценка ответа на лечение ХЛЛ выполнялась в соответствии с критериями, предложенными Международной рабочей группой по ХЛЛ (IWCLL) в 2008 г.
Лечение больных ХЛЛ осуществлялось флударабином в сочетании с циклофосфаном (FC) или в комбинации с циклофосфаном и ритуксимабом (FCR). Для лечения больных НХЛ из малых лимфоцитов применялись курсы по схемам СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон), RCOP (ритуксимаб, циклофосфан, винкристин, преднизолон), CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон), RCHOP (ритуксимаб, циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон).
Фаза дебюта или прогрессии (рецидива) заболевания выявлена у 20 (49 %) больных. Частичная или полная ремиссия после проведённой химиотерапии отмечена у 21 (51 %) пациентов. Фаза дебюта, прогрессии (рецидива) расценена как активная фаза заболевания, фаза частичной или полной ремиссии – как неактивная.
У всех пациентов исследовали спектр спонтанной и митогениндуцированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов: интерферона-γ (ИНФ-γ), фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкина-1β (ИЛ-1β), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина-10 (ИЛ-10), интерлейкина-17 (ИЛ-17), интерлейкина-18 (ИЛ-18), антагониста рецепторов интерлейкина-1 (ИЛ-1РА), моноцитарного хемотаксического белка (МCP-1), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-KСФ), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-KСФ), сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), а также антител к интерферону-α (АТ к ИНФ-α) в динамике химиотерапии: до начала лечения и через 6–8 курсов (через 4–6 месяцев).
Для исследования спонтанной и митогениндуцированной продукции цитокинов клетками крови использовали набор реагентов «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ». Непосредственно после отбора из кубитальной вены 1 мл крови вносили во флакон, содержащий 4 мл поддерживающей среды (DMEM), гепарин (2,5 ед./мл), гентамицин (100 мкг/мл), и L-глютамин (0,6 мг/мл). Этот флакон использовали для изучения спонтанной продукции цитокинов. Для митогенной стимуляции 1 мл полученной разбавленной крови переносили во флакон со смесью поликлональных активаторов: липополисахарида, конканавалина А, фитогемагглютинина P и фитогемагглютинина М. Оба флакона инкубировали в течение суток при 37 °С, затем клетки крови осаждали на центрифуге при 10000 G в течение 3 мин, супернатант после отделения осадка замораживали и хранили при –40 °С до проведения количественного анализа цитокинов. Концентрацию цитокинов в исследуемых образцах оценивали с помощью соответствующих иммуноферментных наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Концентрация измерялась в пг/мл.
Группу контроля по уровню спонтанной и митогениндуцированной продукции цитокинов клетками крови, сопоставимую по полу и возрасту с группами пациентов, составили 67 условно здоровых доноров.
Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы SPSS (версия 17.0). Результаты представлены в виде M ± σ, где М – среднее арифметическое значение, σ – стандартное отклонение. Различия считались достоверными при значении вероятности ошибки (р) < 0,05. Сравнения средних значений различных выборок производили с помощью U-теста по методу Манна – Уитни (непараметрического теста), который применяется там, где выборки из переменных, принадлежащих к интервальной шкале, не подчиняются нормальному распределению.
Клинико-морфологические исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинской Декларации (2000 г.). Программа исследования была рассмотрена и одобрена на заседании этического комитета ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница».
Результаты исследования и их обсуждение
В активной фазе ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов выявлено выраженное увеличение спонтанной продукции колониестимулирующих факторов по сравнению с группой контроля: Г-КСФ в 233,7 (р = 0,001) раза, ГМ-КСФ в 12,5 (р < 0,001) раза. Обнаружено повышение продукции таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-18 (спонтанной – в 1,8 раза (р = 0,001), митогениндуцированной – в 1,6 раза (p < 0,001)) и VEGF (митогениндуцированной продукции – в 2,9 раза (р = 0,016)).
У пациентов в неактивной фазе заболевания установлен повышенный уровень спонтанной продукции колониестимулирующих факторов по сравнению с группой контроля: Г-КСФ в 8,3 раза (р = 0,010), ГМ-КСФ в 5,5 раза (р < 0,001). Повышенной оказалась спонтанная продукция ИЛ-4 в 10,4 раза (р < 0,001) и митогениндуцированная продукция ИЛ-4 – в 1,3 раза (р = 0,039).
В активной фазе отмечалось понижение продукции ИЛ-2: спонтанной – в 2,6 раза (р < 0,001), митогениндуцированной – в 3,4 раза (р < 0,001), выявлено снижение митогениндуцированной продукции ИЛ-4 в 1,15 раза (р = 0,042).
В ремиссии оказалась сниженной спонтанная продукция ИЛ-6 в 10,5 раза (р < 0,001), ИЛ-17 в 4,9 раза (р < 0,001), ФНО-α в 3,8 раза (р < 0,001) и ИЛ-1β в 4,0 раза (р = 0,002), ИЛ-2 в 1,7 раза (р < 0,001), митогениндуцированная продукция ИЛ-6 в 2,3 раза (р < 0,001), ИЛ-17 в 2,1 раза (р = 0,019), ФНО-α в 2,6 раза (р = 0,001) и ИЛ-1β в 1,9 раза (р = 0,039), а также спонтанная продукция ИЛ-1РА в 2,1 раза (р = 0,034), ИЛ-10 в 1,7 раза (р = 0,001) и митогениндуцированная продукция ИЛ-10 в 2 раза (р = 0,001).
При сравнении продукции цитокинов в активной и неактивной фазах выявлено, что в дебюте или прогрессии заболевания спонтанная продукция таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-17, MCP-1, ФНО-α, а также митогениндуцированная продукция ИЛ-6 достоверно выше, чем в ремиссии (в 4,2 раза (р = 0,030), в 9,6 раз (р = 0,028), в 2,0 раза (р = 0,027), в 3,1 раза (р = 0,008), в 8,5 раза (р = 0,014), в 1,7 раз (р = 0,036) соответственно. В то же время уровень спонтанной продукции ИЛ-4 в активной фазе ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов оказался ниже, чем в ремиссии в 2,2 раза (р = 0,027).
Спонтанная и митогениндуцированная продукция остальных цитокинов в дебюте или прогрессии, а также в ремиссии ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов была не изменена. Полученные результаты представлены в табл. 1, 2 и 3.
Таблица 1
Уровень продукции провоспалительных цитокинов в дебюте или прогрессии и в ремиссии лимфопролиферативных заболеваний, M ± σ
|
Цитокины, пг/мл |
Контрольная группа (n = 67) |
Пациенты в дебюте или прогрессии (n = 20) |
Пациенты в ремиссии (n = 21) |
Р |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
сИЛ-2 |
2,59 ± 0,59 |
1,02 ± 0,31 |
1,53 ± 0,49 |
Р1,2 = 0,001 Р1,3 < 0,001 |
|
мИЛ-2 |
77,94 ± 10,65 |
23,13 ± 7,06 |
33,94 ± 11,60 |
Р1,2 < 0,001 Р1,3 < 0,001 |
|
сИЛ-6 |
695,90 ± 223,22 |
275,87 ± 126,32 |
66,00 ± 39,66 |
Р1,2 < 0,001 Р2,3 = 0,030 |
|
мИЛ-6 |
25097,31 ± 2080,28 |
18761,47 ± 1728,90 |
11046,33 ± 2113,38 |
Р1,3 < 0,001 Р2,3 = 0,036 |
|
сИЛ-8 |
1979,54 ± 288,05 |
3914,93 ± 1299,04 |
406,87 ± 137,84 |
Р1,3 < 0,001 Р2,3 = 0,028 |
|
сИЛ-17 |
4,37 ± 0,85 |
1,45 ± 0,67 |
0,87 ± 0,22 |
Р1,2 < 0,001 Р1,3 < 0,001 Р2,3 = 0,027 |
|
мИЛ-17 |
97,93 ± 15,48 |
93,32 ± 22,91 |
45,83 ± 13,22 |
Р1,3 = 0,019 |
|
сИЛ-18 |
51,1 ± 2,50 |
89,91 ± 12,39 |
118,74 ± 30,48 |
Р1,2 = 0,001 Р1,3 = 0,001 |
|
сФНО-α |
36,77 ± 8,96 |
82,51 ± 42,27 |
9,68 ± 2,91 |
Р1,3 < 0,001 Р2,3 = 0,014 |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
мФНО-α |
3866,26 ± 404,17 |
1430,29 ± 168,73 |
1486,19 ± 246,51 |
Р1,2 < 0,001 Р1,3 = 0,001 Р2,3 = 0,034 |
|
cVEGF |
51,67 ± 8,86 |
66,55 ± 25,94 |
54,26 ± 25,22 |
Р1,3 = 0,032 |
|
мVEGF |
33,98 ± 5,73 |
99,89 ± 20,94 |
116,20 ± 41,54 |
Р1,2 = 0,016 |
|
сИЛ-1β |
99,67 ± 32,57 |
386,06 ± 233,16 |
24,60 ± 11,49 |
Р1,3 = 0,013 |
|
мИЛ-1β |
2360,30 ± 271,98 |
2421,30 ± 703,48 |
1249,71 ± 165,54 |
Р1,3 = 0,039 |
|
сМCP-1 |
Нет данных |
1270,87 ± 334,68 |
404,83 ± 129,95 |
Р2,3 = 0,008 |
Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3 обозначены достоверные отличия соответствующих показателей между: Р1,2 – пациентами контрольной группы и пациентами с заболеванием в фазе дебюта или прогрессии, Р1,3 – пациентами контрольной группы и пациентами с заболеванием в фазе ремиссии, Р2,3 – пациентами с заболеванием в фазе дебюта или прогрессии и пациентами с заболеванием в фазе ремиссии; с – спонтанная продукция, м – митогениндуцированная продукция.
Таблица 2
Уровень продукции противовоспалительных цитокинов в дебюте или прогрессии и в ремиссии лимфопролиферативных заболеваний, M ± σ
|
Цитокины, пг/мл |
Контрольная группа (n = 67) |
Пациенты в дебюте или прогрессии (n = 20) |
Пациенты в ремиссии (n = 21) |
Р |
|
сИЛ-4 |
0,02 ± 0,01 |
0,12 ± 0,04 |
0,26 ± 0,04 |
Р1,2 = 0,007 Р1,3 < 0,001 Р2,3 = 0,027 |
|
мИЛ-4 |
4,65 ± 1,41 |
4,01 ± 2,50 |
6,11 ± 2,43 |
Р1,2 = 0,042 Р1,3 = 0,039 |
|
сИЛ-10 |
15,56 ± 2,05 |
10,85 ± 4,65 |
8,90 ± 5,82 |
Р1,2 = 0,040 Р1,3 = 0,001 |
|
мИЛ-10 |
231,14 ± 22,93 |
88,74 ± 15,48 |
115,02 ± 25,88 |
Р1,2 < 0,001 Р1,3 = 0,007 |
|
сИЛ-1РА |
1971,38 ± 407,24 |
2422,63 ± 999,34 |
933,98 ± 358,74 |
Р1,3 = 0,034 |
Таблица 3
Уровень продукции колониестимулирующих факторов в дебюте или прогрессии и в ремиссии лимфопролиферативных заболеваний, M ± σ
|
Цитокины, пг/мл |
Контрольная группа (n = 67) |
Пациенты в дебюте или прогрессии (n = 20) |
Пациенты в ремиссии (n = 21) |
Р |
|
сГ-КСФ |
0,47 ± 0,25 |
109,84 ± 54,24 |
3,90 ± 1,74 |
Р1,2 = 0,001 Р1,3 = 0,010 |
|
сГМ-КСФ |
0,37 ± 0,10 |
4,62 ± 1,66 |
2,04 ± 0,52 |
Р1,2 < 0,001 Р1,3 < 0,001 |
Патогенетическая роль Г-КСФ и ГМ-КСФ при ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов ещё не определена. В экспериментальных условиях продемонстрированы противоопухолевые свойства ГМ-КСФ [9, 11]. Вероятно, поэтому продукция этих колониестимулирующих факторов усилена в дебюте или прогрессии лимфопролиферативных заболеваний. Повышенная спонтанная продукция Г-КСФ и ГМ-КСФ при ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов в фазе частичной или полной ремиссии, вероятно, имеет компенсаторный характер в ответ на угнетение миелоидного ростка после проведённой химиотерапии.
Полученные в нашей работе результаты о повышении спонтанной и митогениндуцированной продукции ИЛ-18 при ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов, возможно, связаны с тем, что нарушение продукции данного цитокина и/или его рецепторов опухолевыми клетками в некоторых случаях способствует росту опухоли, как показано при ХЛЛ [5].
Обнаружено, что у пациентов с ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов в фазе дебюта или прогрессии повышен уровень митогениндуцированной продукции VEGF, что, вероятно, связано с повышенной способностью к опухолевому росту и метастазированию [8].
Повышенная спонтанная и митогениндуцированная продукция ИЛ-4 в ремиссии ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов по сравнению с группой контроля объясняется участием данного цитокина в активации противоопухолевого иммунитета [12]. Более высокий уровень спонтанной продукции ИЛ-4 в ремиссии заболевания по сравнению с дебютом или прогрессией позволяет рассматривать данный факт как возможный дополнительный критерий оценки прогноза.
Снижение спонтанной и митогениндуцированной продукции ИЛ-2 в активной фазе ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов описано также в работе Н.П. Домниковой и соавт. [1].
Ремиссия лимфопролиферативных заболеваний, достигнутая в результате проведённой химиотерапии, сопровождается снижением продукции про- и противовоспалительных цитокинов. Вероятно, это связано с применением преднизолона и цитостатиков, входящих в схемы лечения и обладающих иммунодепрессивным эффектом [3].
Заключение
Дебют или прогрессия ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов сопровождается преимущественно повышением уровня ряда провоспалительных цитокинов, за исключением ИЛ-2, продукция которого понижена.
На фоне химиотерапии в ремиссии лимфопролиферативных заболеваний наблюдается снижение уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, за исключением уровня ИЛ-4, продукция которого повышена по сравнению с дебютом или прогрессией и контрольной группой.
Уровень колониестимулирующих факторов повышен как в дебюте или прогрессии, так и в ремиссии ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов.
Таким образом, полученные результаты расширяют представление о ключевых моментах патогенеза ХЛЛ и НХЛ из малых лимфоцитов, что даёт потенциальные точки приложения действия препаратов для лечения этих лимфопролиферативных заболеваний.
Рецензенты:
Гуляева Л.Ф., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза, ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;
Сидорова Л.Д., д.м.н., профессор, академик РАН, профессор кафедры внутренних болезней, Новосибирский государственный медицинский университет МЗ РФ, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 15.09.2014.