В развитии и поддержании повреждений, в частности слизистой оболочки желудка, первостепенное значение принадлежит центральной нервной системе, ее вегетативному отделу с их медиаторами и гистогормонами [2].
Особенностью является то, что эти активные вещества (ацетилхолин, адреналин, серотонин, цитокины и т.д.) участвуют в норме в физиологической регуляции различных функций органов системы пищеварения [4].
Повышение уровня серотонина в ткани слизистой оболочки имеет место при различных повреждениях желудка [5, 6]. Повышение серотонина сопровождается появлением в ткани протеолитической активности при рН 6,5–7,0. В этой связи вырисовывается патогенетическая цепочка серотонин > протеолитическая активность (при р 6,5–7,0) > повреждение. Прослеживается определенная последовательность событий в слизистой оболочке желудка при повреждении под воздействием избыточных доз провоспалительных факторов. Биогенные амины, гормоны и цитокины – активные соединения, в физиологических условиях обеспечивающие гомеостаз тканей организма, в условиях гиперпродукции и локального достижения критической концентрации из физиологических регуляторов превращаются в свою противоположность – в медиаторы раннего периода местного воспаления [4]. Происходит нарушение проницаемости лизосомных мембран с последующим высвобождением тканевых лизосомных гидролаз, обладающих цитотоксическим действием в толще ткани слизистой оболочки желудка. Выполняя роль фактора, инициирующего деструкцию клеток слизистой, воздействие лизосомальных ферментов, а также кислотно-пептического фактора самого желудка на слизистую оболочку желудка со стороны его просвета усугубляет начавшийся в глубине ткани процесс повреждения и является дополнительным фактором развития и поддержания деструкции ткани. Эти сдвиги сопровождаются определенными изменениями содержания ацетилхолина, серотонина и цитокинов в слизистой оболочке и сыворотке крови [3]. Серотонин при экзогенном введении интактным животным (крысы) вызывает повреждение слизистой оболочки желудка.
Формирование деструкции происходит в том участке, где имеет место накопление избыточных количеств биогенных аминов, гистогормонов и цитокинов. Указанные биологически активные вещества в физиологических условиях участвуют в регуляции микроциркуляции, обеспечивая устойчивость клеточных и межклеточных мембран (к этому процессу причастны не только биогенные амины, но и цитокины).
Подводя итоги изложенным материалам, можно утверждать, что формирование деструкции в эксперименте и в клинике связано с высвобождением лизосомальных ферментов, которые проявляют внутритканевый аутолитический эффект и обеспечивают формирование деструкции, возникающей первоначально в толще слизистой оболочки желудка. Высвобождение указанных ферментов становится возможным, как указывалось выше, благодаря избыточной продукции биологически активных веществ, концентрация которых достигает в определенной точке слизистой оболочки желудка критического уровня. Именно благодаря этому в данной точке происходит дестабилизация гомеостаза слизистой оболочки с локальным нарушением микроциркуляции, проницаемости клеточных мембран и мембран клеточных органелл, что ведет к выходу ферментов за «дозволенные» в условиях нормы пределы, т.е. в цитозоль и далее в межклеточную среду, таким образом, развивается типичный воспалительный процесс.
Учитывая вышеизложенное, нами было проведено экспериментальное исследование по определению биологически активных веществ в экстрактах слизистой оболочки в зоне операционного шва у белых крыс после оперативного вмешательства – резекции 1/3 желудка по большой кривизне.
Цель исследования – определить содержание серотонина и его влияние на воспалительный процесс при операциях на желудке у крыс.
Материал и методы исследования
Животные. В качестве объекта исследований использовали белых крыс, массой 180,0–220,0, породы Wistar, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных» при Филиале института биоорганической химии РАН. Животных содержали согласно соответствующим нормативам ГОСТа, с учетом общепринятых в мире стандартов гуманного использования животных при проведении экспериментального исследования. В России были приняты международные правила GLP (Приказ МЗ РФ от 19 июня 2003 г. № 267. Правила надлежащей лабораторной практики). Ранее была подписана Хельсинская декларация и приняты РФ принципы биоэтики (редакция 1964 г. и последующие редакции). Для обезболивания использовали эфирный наркоз. Эфир давали из расчета 3–5 мл на 1 кг массы тела через маску в смеси с атмосферным воздухом. Перед оперативным вмешательством крыс не кормили 18 часов, оставляя свободный доступ к воде. Под эфирным наркозом по срединной линии вскрывалась передняя брюшная стенка. Желудок брался на зажим. Производилась продольная резекция 1/3 желудка по большой кривизне. Послеоперационная рана желудка ушивалась двухрядным швом: первый серозно-мышечный, второй – серо-серозный, нитью Викрил 6-0. Желудок погружался в брюшную полость. Передняя брюшная стенка ушивалась непрерывным швом. Узловые швы на кожу.
Для проведения исследования животные были распределены на группы в зависимости от динамики развития и заживления операционной раны. Серотонин (5-НТ) определяли через 1 час, 72 часа и 10 суток. Иссекали 50 мг слизистой без серозной оболочки, тщательно промокали и гомогенизировали в подкисленном бутаноле, используя тефлоновый гомогенизатор. Конечный объем гомогената 4,0 мл. Все манипуляции проводили на холоде. Содержание серотонина определяли по методу Sadovanqvivad Ch. путем гомогенизации в охлажденном бутанол-солянокислом растворе [6]. Экстракт центрифугировали в течение 15 минут при 4000 об/мин. Прозрачную надосадочную жидкость сливали в пробирку с притертой пробкой.
При этом способе из тканей извлекается гистамин, серотонин, дофамин и норадреналин. Затем порцию бутанолового экстракта обрабатывали для определения в ней серотонина. Последующие этапы окисления проводили по модификации Бассалык Л.С. [7]. Все реактивы были приготовлены на трижды перегнанной воде.
Результаты исследования и их обсуждение
Динамическое наблюдение изменений содержания 5-НТ в экстрактах слизистой оболочки желудка при экспериментальной операционной ране выявило определенную закономерность в развитии патологического процесса (табл. 1). Повышение содержания 5-НТ в экстрактах слизистой оболочки желудка в первый час после оперативного вмешательства достигает 3,9 ± 0,4 мкг/г ткани, в контроле 1,4 ± 0,2 мкг/г ткани (р < 0,001). При перерасчете на грамм сухого вещества содержание 5-НТ в отечный период (60 мин) надо умножать на 10. В период рубцевания раны (10 сутки) в окружающей ткани увеличено число тучных клеток, и уровень серотонина вновь повышается до 4,1 ± 0,5 мкг/г ткани (р < 0,001). В этот период при внешнем осмотре отек ткани отсутствует, и содержание 5-НТ не имеет различий при расчете на грамм сухого вещества.
Первый час после воздействия сопровождается значительным повышением серотонина на 279 %, сочетаясь с нарушением проницаемости сосудов, стазом, наблюдается маятникообразный и обратный ток крови, застой в оттекающей части микроциркуляторного русла. Снижается кровоток и в притекающей части микроциркуляторного русла, вызывая спазм артерий и артериол, все это способствует развитию гипоксии ткани. С другой стороны, тромбообразование и спазм артериол предупреждает поступление биологически активных веществ с места повреждения в общий кровоток.
Таблица 1
Содержание серотонина в слизистой оболочке желудка крыс в норме и при экспериментальной послеоперационной ране
|
n = 5 |
Контроль |
3 суток |
5 суток |
10 суток |
|
Серотонин, мкг/г ткани |
1,4 ± 0,2 |
4,3 ± 0,3 |
2,8 ± 0,2 |
3,1 ± 0,5 |
|
р |
< 0,001 |
< 0,01 |
< 0,001 |
Анализ данных, полученных в условиях экспериментального исследования, позволяет считать, что развитие воспалительной реакции в зоне повреждения происходит из-за того, что снижены защитные механизмы на фоне повышения агрессивных факторов. Повреждены регуляторные механизмы, нарушается динамическое равновесие между нейрогуморальными агентами. Процесс дисрегуляторных нарушений является сложным переплетением гормональных и нервных регуляций. В более поздние сроки в процесс воспаления включается иммунная система. Таким образом, с первого часа после операции в зоне послеоперационного шва в ткани повышается содержание серотонина как медиатора воспаления. Воспаление — типический патологический процесс, который развивается при повреждении тканей и проявляется нарушением кровообращения [3].
В свете современных данных ясно, что воспалительный процесс является комплексом сложных реакций, каждая из которых может доминировать в клинико-патологической картине и которые приводят к расстройствам физического и биохимического равновесия в тканях. В начале острое воспаление, затем включаются механизмы с элементами заживления. Все это сопровождается биохимическими и клеточными изменениями, каждое из которых может доминировать в клинико-патологической картине. Три часа с начала формирования воспалительного процесса операционного шва у животных предшествует максимальным деструктивным процессам, и в этот период в поврежденной ткани происходит одновременное повышение содержание серотонина.
5-НТ, являясь медиатором воспаления, играет важную роль в развитии реакции воспаления в месте повреждения, способствуя нарушению кровотока. Микроциркуляторное русло слизистой оболочки построено по классическому типу, состоит из приводящей части, куда входят артерии, артериолы разного размера, прекапиллярные артериолы, метартериолы. Обменной части – прекапиллярный сфинктер, капилляры, сборная венула, переходящая в оттекающую часть – посткапиллярные венулы, венулы и вены.
Кровоток слизистой оболочки желудка разделяется на 3 отдела: серозный, подслизистый и собственно слизистой оболочки желудка. Во всех этих отделах кровообращение связано, но в то же время автономно. Емкость и распределение крови в разных отделах микроциркуляторного русла регулируется вазомоцией – спонтанным сужением и расширением метартериол и прекапиллярных сфинктеров. Обычно фазы сокращения и расслабления длятся от нескольких секунд до нескольких минут. Фаза дилятации более выражена – 30–260 с, фазы сокращения – 10–120 с. Интервал между фазами 2–5 с.
Наиболее значительные повреждения слизистой оболочки желудка происходят при нарушении кровотока в подслизистом слое, который одновременно обеспечивает кровоток слизистой. Снижение или повышение кровотока в серозной оболочке также компенсируется кровотоком подслизистого слоя, развитием коллатералей и открытием артериовенозных анастомозов.
На интактных животных была проведена серия исследований в которой были показаны доззависимые изменения архитектоники микроциркуляторного русла после введения серотонина (рис. 1, 2, 3, 4). Происходит сужение артериол, продолжается от 100 до 200 с (норма 10–120 с), было зафиксировано их полное «исчезновение» Значительно расширены капилляры и сборные венулы, они полнокровны, нарушена проницаемость стенки сосудов, происходит выход форменных элементов крови в окружающую ткань с образованием обширных кровоизлияний и отека. Венулы расширены, полнокровны, стаз, наблюдается агрегация форменных элементов крови, образование тромбов, стенки сосудов легко повреждаются контактным объективом. Артерии и артериолы сужены, уменьшен приток крови, одновременно венулы и вены расширены, полнокровны, венозный застой.
Рис. 1. Микрососуды подслизистого слоя слизистой оболочки желудка крыс после введения серотонина в дозе 15 мг/кг, артериолы в состоянии систолы, полностью «исчезают», агрегаты в венулах. Ув. 160
Рис. 2. Микрососуды подслизистого слоя слизистой оболочки желудка крыс после введения серотонина 30 мг/кг. Метартериолы отсутствуют, «прерывистый» кровоток в венулах, агрегация форменных элементов крови. Ув. 160
Рис. 3. Введение серотонина (30 мг/кг). Стаз в венулах и капиллярах, обширные, слитые кровоизлияния по ходу сосудов. Ув. 100
Рис. 4. Введение серотонина (30 мг/кг), образование эрозии слизистой оболочки желудка
Введение 5-НТ вызывает нарушение кровотока через 2–5 минут, продолжается оно 30–40 мин. Серотонин повреждает все три части микроциркуляторного русла (притекающую, обменную и оттекающую), способствует образованию повреждений слизистой оболочки желудка. При внешнем осмотре слизистая оболочка желудка отечна, слитые кровоизлияния по ходу сосудов, эрозии.
Таблица 2
Содержание серотонина (мкг/г ткани) в слизистой оболочке желудка у интактных животных и после внутрибрюшинного введения серотонина
|
Контроль |
Введение серотонина в дозе 30 мг/кг, интактным животным |
1 час после операции |
|
1, 8 ± 0,4 |
2,9 ± 0,5 |
3,9 ± 0,4 |
|
Р < |
0,05 |
< 0,001 |
Исследования на интактных животных при введении им 5-НТ убедительно показали, что 5-НТ в вводимой дозе, которая вызывает повышение 5-НТ в слизистой оболочке желудка 2,9 ± 0,5 (табл. 2), способствует нарушению кровотока и образованию повреждений. У опытных животных в зоне операционного шва содержание 5-НТ значительно превышает его при экзогенном введении.
Вывод
При данной экспериментальной модели доказано, что длительное нарушение кровотока в месте повреждения и окружающих тканях вызывает гипоксию, некроз и прогрессирующую энергетическую недостаточность, приводящую к метаболическим нарушениям, которые влияют на качество заживления операционной раны. Таким образом, высокое содержание серотонина не только сочетается с повышением других агрессивных факторов, но и является пусковым моментом для запуска всех повреждающих факторов.
Рецензенты:
Белостоцкий Н.И., д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории доклинических исследований, ГБУЗ «Московский клинический научно-практический центр» ДЗМ, г. Москва;
Варванина Г.Г., д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории научно-диагностических исследований, ГБУЗ «Московский клинический научно-практический центр» ДЗМ, г. Москва.
Работа поступила в редакцию 08.09.2014.