Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Многочисленными исследованиями показано, что одним из ключевых патогенетических звеньев формирования тяжелых и осложненных форм гриппа, в том числе вызванного вирусом типа А H1N1pdm09 (причина последней крупной эпидемии в XXI веке), является гиперцитокинемия, часто коррелирующая с неблагоприятным исходом болезни [9, 11]. Интимные механизмы патогенеза гриппа А H1N1pdm09, унесшего более 18 тысяч человеческих жизней, до настоящего времени служат объектом пристального исследования. Проводимые ранее исследования Kido H. (2010) тяжелых форм гриппа А H5N1 (птичий грипп) также продемонстрировали роль гиперцитокинемии в формировании полиорганной недостаточности и отека, обусловленные активацией цикла трипсин/матриксная металлопротеаза-9 в клетках (особенно в эндотелиоцитах), приводя к разрушению матрикса вокруг микрососудов, увеличению сосудистой проницаемости с подавлением в клетках продукции аденозинтрифосфата, что вызывает «энергетический кризис клеток» [7].

Матриксные маталлопротеазы (ММР) – группа родственных по структуре цинкзависимых эндопептидаз, участвующих в деградации базальной мембраны и внеклеточного матрикса. ММР – единственные протеолитические ферменты, способные денатурировать фибриллярные коллагены. В состав ММР входит 28 ферментов, которые делятся на пять подсемейств: коллагеназы (ММР-1, ММР-8, ММР-13), стромализины (ММР-3, ММР-10), матрилизины (ММР-7, ММР-26) и желатиназы (ММР-2, ММР-9). К соединениям, образуемым эндотелиальными клетками, относятся коллагеназы, стромализины и желатиназы, секретирующиеся в физиологических условиях в межклеточное пространство и разрушающие фибриллярные коллагены, фибронектин и другие белки внеклеточного матрикса [2]. Кроме того, ММР экспрессируются в мышечных клетках и фибробластах [3]. Установлено, что ММР-2, в отличие от ММР-9, экспрессируется в поврежденных артериях, благодаря чему является одним из маркеров воспаления [1]. Содержание ММР в физиологических условиях регулируется содержанием специфических тканевых ингибиторов матриксных металлопротеаз (MMPTI), представляющих собой небольшие белки, вступающие во взаимодействие с MMP в соотношении 1:1. Но MMPTI могут инактивироваться действием протеолитических ферментов – трипсина, хемотрипсина, эластазы нейтрофилов, благодаря чему значительно возрастает активность различных ММР [8]. Проведенные исследования показали, что при заболеваниях сердечно-сосудистой системы в сыворотке крови нарушается нормальное соотношение MMP и MMPTI, приводящее к развитию фиброза [1, 2].

Однако изучение системы «матриксные металлопротеазы – ингибитор матриксных металлопротеаз» практически не коснулось гриппа А H1N1pdm09. Тем не менее единичные исследования in vitro, проведенные во время эпидемии гриппа А H1N1pdm09, показали увеличение экспрессии MMP-2 нейтрофилами и эндотелиоцитами легких у умерших пациентов с проявлениями острого респираторного дистресс-синдрома на фоне вирус-индуцированной пневмонии [4].

Цель исследования – изучить содержание матриксных металлопротеаз (MMP-2, MMP-9) и их специфических ингибиторов у детей с неосложненным гриппом и при его течение, осложненном пневмонией.

Материалы и методы исследования

В исследование включен 201 ребенок с гриппом А H1N1pdm09, рандомизированный в две группы: первую группу составили 114 детей с неосложненным гриппом. Для определения тяжести течения гриппа А H1N1pdm09 пользовались общепринятой классификацией гриппа [5]. Группу сравнения для этой группы составили 27 детей с сезонным гриппом A H3N2 в постэпидемический период. 87 детей с развившейся внебольничной вторичной вирусно-бактериальной пневмонией на фоне пандемического гриппа объединены во вторую группу. Диагноз внебольничной пневмонии устанавливался на основании достоверных критериев, предложенных А.Г. Чучалиным и соавт. [6]. В качестве критериев тяжести внебольничной пневмонии у детей использовали модифицированную шкалу тяжелых внебольничных пневмоний у взрослых (2007) [10]. Группой сравнения для второй клинической группы стали 50 детей с внебольничной пневмонией в постэпидемический по гриппу период. Дети с атипичной этиологией внебольничной пневмонии (микоплазменная, хламидийная) из данной группы исключались.

Диагноз гриппа А H1N1pdm09 устанавливался на основании эпидемиологического анамнеза, комплекса характерных клинических симптомов и верифицировался путем обнаружения РНК вируса в назофарингеальных мазках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в парных сыворотках с нарастанием тира антител. Сезонный грипп устанавливался на основании идентификации РНК вируса гриппа A H3N2 в назофарингеальных мазках.

Распределение исследуемых по группам, полу и возрасту представлено в табл. 1.

Таблица 1

Распределение больных по группам, полу и возрасту

Контрольную группу составили 20 здоровых детей, сопоставимые по возрасту и полу с исследуемыми клинических групп.

Объектом для исследования явилась сыворотка крови. Количественное содержание ММР-2 и ММР-9 оценивали с использованием тест-систем «Quantikine MMP-2 и MMP-9 Immunoassay» производства R&D Systems, США. Определение концентрации MMPTI проводили тест-системой «BioSource HuTIMP-1 kit» производства BioSourse Europe S.A., Бельгия. Все измерения проводили с помощью автоматического вертикального фотометра «Multiscan MCC 340» согласно требованиям тест-систем. После чего производился расчет отношения ММР-2 и ММР-9 к MMPTI.

Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы «BIOSTAT». Количественные данные выражали в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD). Достоверность различий между двумя независимыми совокупностями оценивали с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни. Различия сравниваемых показателей считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Известно, что выраженность клинических симптомов заболевания определяется степенью активности иммунных реакций, в процессе которых реализуется эффекторный цитолитический потенциал к вирус-инфицированным клеткам-мишеням при помощи физиологически активных медиаторов микробоцидного действия – катионных белков: ферментных (миелопероксидаза, лизоцим, эластаза) и неферментных (лактоферрин, ферритин, дифензины), осуществляющих нарушение целостности клеточной оболочки возбудителя и блокаду в нем ключевых метаболических процессов, благодаря действию продуктов метаболизма арахидоновой кислоты, секретируемых нейтрофилами в околоклеточное пространство, стимулирующих образование свободных радикалов и окиси азота, также необходимых для инактивации возбудителя. Поэтому нами первоначально исследовано содержание ММР-2, ММР-9, MMPTI в сыворотке крови у больных с неосложненным течением гриппозной инфекции.

Нами установлено, что уровень ММР-2, ММР-9, MMPTI достоверно отличался у пациентов с тяжелым и среднетяжелым течением гриппа А H1N1pdm09 (табл. 2).

Таблица 2

Содержание ММР-2, ММР-9, MMPTI в сыворотке крови у больных с неосложненным гриппом, M ± SD

Примечания: * – статистическая значимость различий с контролем;

** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения.

Между тем в группе детей с сезонным гриппом, а также при легком течении пандемического гриппа уровень исследуемых металлопротеаз не только не отличался от группы здоровых детей, но и не нарушалось физиологическое отношение данных металлопротеаз к их специфическому ингибитору. Продукция ММР-2, ММР-9 у детей со среднетяжелой формой гриппа A H1N1pdm09 превышала показатели контроля и аналогичные показатели при сезонном гриппе в 2,4 и 2,3 раза соответственно (p = 0,0001), тогда как тяжелое течение пандемического гриппа сопровождалось более высоким содержанием ММР-2, ММР-9, превышая показатели здоровых детей в 3,1 раза, а уровень у больных с гриппом A H3N2 – в 2,8 раза (p = 0,0001). Кроме того, отмечено, что при тяжелом течении гриппа наблюдалась не только гиперпродукция металлопротеаз, но и нарушалось их физиологическое отношение с продукцией MMPTI (p = 0,0001).

Содержание ММР-2, ММР-9, MMPTI у больных с осложненным течением гриппа представлено в табл. 3.

Уровень исследуемых металлопротеаз повышался во всех исследуемых нами группах больных с пневмонией относительно здоровых индивидуумов. При этом обнаружено, что если при пневмонии, этиологически не связанной с пандемическим гриппом, уровень ММР-2 и ММР-9 превышал контрольные значения в 1,8 и 2,5 раза, независимо от тяжести ее течения, то значения исследуемых металлопротеаз при осложненном гриппе A H1N1pdm09 превышали аналогичные показатели соответственно в 3,4 и 4,1 раза. Причем тяжелое течение пневмонии при пандемическом гриппе сопровождалось более значимым повышением уровня ММР-2 и ММР-9 не только по сравнению с контролем и группой сравнения (р = 0,0001), но и относительно детей с нетяжелыми формами пневмонии при гриппе A H1N1pdm09 (р = 0,0001). Повышение показателей соотношения ММР-2 и ММР-9 к MMPTI также отмечено во всех исследуемых группах больных с пневмонией, исключая соотношение ММР-9 к MMPTI у детей с тяжелой пневмонией группы сравнения (р = 0,061). Показатель отношения исследуемых металлопротеаз к их физиологическому ингибитору максимально увеличивался у детей с тяжелой пневмонией при гриппе и достоверно отличался от группы детей с нетяжелым ее течением (р = 0,0001).

Таблица 3

Содержание ММР-2, ММР-9, MMPTI в сыворотке крови у больных с осложненным гриппом, M ± SD

Примечания: * – статистическая значимость различий с контролем;

** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения (нетяжелая пневмония);

*** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения (тяжелая пневмония).

В ходе проводимого исследования нас интересовали и возможные различия между содержанием изучаемых показателей в сыворотке крови у детей с неосложненным течением пандемического гриппа и при уже развившейся пневмонии. Нами зафиксировано, что различия всех исследуемых показателей у детей с тяжелой пневмонией при пандемическом гриппе значительно превышали аналогичные у детей с тяжелым гриппом (р = 0,0001). Помимо этого, уровень ММР-2, ММР-9, MMPTI у детей с тяжелым течением гриппа превышал таковые показатели у детей с пневмонией, этиологически не связанной с гриппом H1N1pdm09, что подтверждает потенциальную способность вируса пандемического гриппа к фиброзу легочной ткани.

Таким образом, превышение показателей ММР-2, ММР-9 и MMPTI у детей со среднетяжелым и тяжелым течением гриппа обуславливает течение физиологических процессов, приводящих к инактивации патогена. Однако выявленные нарушения при данных формах физиологического соотношения исследуемых металлопротеаз к их ингибитору могут объяснить, с одной стороны, интенсивность воспалительной реакции, характерной для более тяжелых форма гриппа, а с другой стороны, уже на этой стадии патологического процесса может стать значимым фактором риска развития фиброза легочной ткани. Гиперпродукция металлопротеаз при пневмонии, обусловленной вирусом гриппа H1N1pdm09, должна расцениваться как фактор риска не только тяжелого течения пневмонического процесса, но и свидетельствовать о риске развития фиброза легочной ткани, что требует тщательного катамнестического наблюдения за данной категорией пациентов.

Рецензенты:

Цыбиков Н.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;

Гаймоленко И.Н., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой госпитальной педиатрии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.

Работа поступила в редакцию 15.09.2014.