Как свидетельствуют исследования последних лет, РМЖ является гетерогенным заболеванием [2; 3]. Выявление все новых и новых молекулярно-генетических и иммунногистохимических маркеров и их корреляций позволяет индивидуализировать тактику лечения больных [1]. Ключевыми белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства BCL-2 и супрессор опухолевого роста р53. Частота встречаемости экспрессии BCL2 (BCL2+) составляет, по данным разных авторов, от 54,1 % до 75,7 % [10; 9]. Некоторыми авторами проведены исследования по ассоциации BCL2+ с тем или иным молекулярно-биологическим подтипом РМЖ. Так, например, по данным [4], у 70 % больных ТНР выявлено отсутствие экспрессии BCL2 (BCL2-), что коррелировало с высокой пролиферативной активностью опухоли. Эти же данные о достаточно низкой экспрессии BCL2 подтверждены и в других исследованиях, где, помимо низкого уровня экспрессии BCL2, при ТНР отмечено высокое содержание p53 и высокая частота мутаций BRCA1 [8; 11]. Клинико-морфологическое исследование на материале 61 пациентки [12] выявило, что BCL2+ ассоциировано со старшим возрастом, постменопаузой, люминальным подтипом опухоли (особенно А), отсутствием гиперэкспресии или амплификации гена HER2neu, низкой или средней степенью ее злокачественности. При этом средний возраст больных BCL2+ достоверно выше, чем больных BCL2- (62 года против 53). А вот экспрессия р53 (р53+), по данным литературы, наоборот, связана с негативными рецепторами эстрогенов, HER2neu+ и высокой степенью злокачественности опухоли [5]. Так, повышенная экспрессия Всl-2 при РМЖ коррелирует с наличием в опухоли рецепторов эстрогенов и прогестерона [7]. По мнению Callagy G. и соавторов, это объясняется положительной эстроген-рецептор-зависимой регуляцией экспрессии Bcl-2 [6]. Таким образом, данные литературы по частоте встречаемости и корреляции экспрессии BCL2 и р53 с молекулярно-биологическими подтипами РМЖ носят разрозненный характер и касаются в основном ТНР. Более того, результаты исследований часто мало сопоставимы, ввиду того, что принципы деления РМЖ на подтипы менялись с течением времени (St.Gallen 2011; 2013).
Материалы и методы исследования
Была изучена экспрессия маркеров р53 и bcl-2 в клетках РМЖ 95 пациенток с различными молекулярно-биологическими подтипами с помощью иммуногистохимического метода. Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в табл. 1.
Таблица 1
Панель использованных в исследовании антител
|
Специфичность |
Клон |
Фирма |
Разведение |
Буфер для «демаскировки антигенов» |
|
Нормальный и мутантный тип р53 |
DO-7 |
DAKO |
1:200 |
10 мМ Tris, 1 мМ EDTA (рН 9,0) |
|
Bсl-2 |
Sp 66 |
DAKO |
1:100 |
10 мМ Tris, 1 мМ EDTA (рН 6,0) |
Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65 0С, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97 0С и дальнейшее охлаждение до 65 0С. Затем стекла промывались в течение 1–3 минут TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров: 1) опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по р53, если было окрашено более 25 % ядер опухолевых клеток. 2) опухоль считали отрицательной по bcl-2, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по bcl-2, если было окрашено более 25 % опухолевых клеток. Распределение больных по биологическим подтипам осуществлялось на основании рекомендаций Панели экспертов St.Gallen (2013) и практических рекомендаций RUSSCO (2013). Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0).
Результаты исследования и их обсуждение
Из 95 пациенток у 26 (27,4 %) был определен люминальный А – подтип, у 33 (34,7 %) – люминальный В – подтип, у 15 – HER2neu+ (15,8 %), у 21 – ТНР (22,1 %). Данные по экспрессии р53 и bcl-2 представлены в табл. 2.
Таблица 2
Экспрессия р53 и bcl-2 у больных с различными молекулярно-биологическими подтипами РМЖ
|
экспрессия р53 |
экспрессия bcl-2 |
|
|
Люминальный А (n = 26) |
6 (23,1 %) |
26 (100 %)¹ |
|
Люминальный В (n = 33) |
21 (63,6 %)* |
25 (75,8 %)* |
|
HER2neu+ (n = 15) |
10 (66,7 %)* |
7 (46,7 %)*¹ |
|
ТНР (n = 21) |
10 (47,6 %)* |
7 (33,3 %)*¹ |
Примечания:
* – различия достоверны в отношении люминального А подтипа РМЖ (p ≤ 0,05)
¹ – различия достоверны в отношении люминального В подтипа (p ≤ 0,05)
Проведенное исследование выявило, что практически одинаково часто гиперэкспрессия р53 наблюдалась при люминальном В и Her2neu+ подтипах РМЖ и несколько снижается при ТНР. Накопление р53 при люминальном А – подтипе встречалось в 2 раза реже, чем при ТНР, и в 2,5 раза и 2,7 раза реже, чем при люминальном В и Her2neu+ РМЖ, соответственно. При этом степень ядерной реакции с антителами p53 в ткани опухоли и количество окрашенных клеток отличались. Так, при люминальном А – подтипе клетки стромы опухоли и инфильтрирующие опухоль лимфоциты вообще не окрашивались антителами к р53. Разброс количества окрашенных клеток при данном подтипе находился в пределах от полного отсутствия окрашивания ядер опухолевых клеток до 30 %. Такая же интенсивность окрашивания опухолевых клеток была и при ТНР. А вот при люминальном В разброс клеток по экспрессии данного маркера находился в пределах от 50 % ядер опухолевых клеток до 90 %, в среднем составив 76,8 ± 7,7 %. При HER2neu+ РМЖ отмечалась разнообразная картина. У половины больных процент позитивных клеток превысил уровень «cut-off», но не вышел за пределы 30 %. У другой половины практически все опухолевые клетки имели ядерное окрашивание антителами к р53. В каждом из исследованных случаев отмечалось положительное окрашивание антителами к bcl-2 инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, что являлось для нас внутренним положительным контролем. Среднее содержание опухолевых клеток, положительных по экспрессии bcl-2, в опухолях с люминальным А – подтипом составило 83,5 ± 8,4 %, где разброс находился в пределах от 60 % до 95 %. При люминальном В подтипе среднее содержание bcl-2 положительных опухолевых клеток составило 74,5 ± 3,7 %, где разброс находился от 60 % до 85 % клеток. При Her2neu+ РМЖ количество опухолевых клеток было существенно меньше, по сравнению с люминальными подтипами, и не превысило 30 %. При THР отмечалась такая же разноплановая картина, как и при изучении ядерного окрашивания антителами к р53. У половины больных количество опухолевых клеток, окрашенных антителами к bcl-2, не превышало 30 %, у оставшихся больных в среднем составило 70 %. Обнаружены некоторые различия и в интенсивности окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток в зависимости от молекулярного подтипа РМЖ. Так, при люминальном А – подтипе, как правило, цитоплазма имела яркую или среднюю интенсивность окрашивания, при люминальном В – подтипе у 17 из 25 позитивных случаев имели среднюю интенсивность окрашивания, у 4 – слабую и у 4 – цитоплазма была ярко окрашена антителами к bcl-2. При Her2neu+ РМЖ цитоплазма имела слабую интенсивность окрашивания, при THР одинаково часто была отмечена интенсивность окрашивания слабая и средняя. Таким образом, проведенное исследование экспрессии bcl-2 выявило закономерность снижения частоты позитивных случаев окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток с изменением рецепторного статуса опухоли, а именно, снижение в несколько раз числа позитивных случаев при THР и Her2neu+ подтипах РМЖ.
Рассмотрев соотношение числа положительных случаев по экспрессии p53 к случаям положительной экспрессии bcl-2, выявлено, что наименьшее соотношение (0,25) отмечено при люминальном А молекулярном подтипе, когда при повышении доли опухолей положительных по экспрессии bcl-2 отмечено снижение числа опухолей, позитивно окрашенных антителами к p53. Несколько выше этот показатель отмечен при ТНР и люминальном В – подтипе, составив 0,6 и 0,83 соответственно. Обратная зависимость наблюдалась при Her2+ РМЖ, составив 2, где отмечено преобладание доли опухолей, позитивных по экспрессии p53 над bcl-2+.
Заключение
Таким образом, проведенное исследование подтвердило различие в уровне экспрессии рецепторов белков, участвующих в процессе апоптоза: p53 и BCL-2. Полученные результаты в большинстве своем не противоречат данным литературы. Однако, по нашим данным, уровень экспрессии р53 при люминальных подтипах различен. Если при люминальном А – подтипе он традиционно низкий, то при люминальном В – подтипе, наоборот, высокий и сравним с таковым в гормон-негативных опухолях. На наш взгляд, это объясняется прежде всего неоднородностью люминального В – подтипа. И высокий уровень экспрессии р53 при нем обеспечивается за счет гормон-позитивных опухолей, ассоциированных с гиперэкспрессией или мутацией Her2neu. Скорее всего, именно HER2neu+ статус опухоли наиболее сильно коррелирует с высоким уровнем экспрессии р53, что объясняет его снижение при ТНР. Этот же факт неоднородности люминального В – подтипа объясняет и достоверное снижение экспрессии bcl-2 в люминальных В – опухолях по сравнению с люминальным А – подтипом. Таким образом, полученные результаты предполагают дальнейшие исследования в этом направлении, с целью выявить более специфические различия в молекулярном портрете РМЖ.
Рецензенты:
Ващенко Л.Н., д.м.н., профессор, руководитель отделения опухолей мягких тканей и костей, ФГБУ «РНИОИ», г. Ростов-на-Дону;
Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Южного научного центра РАН, г. Ростов-на-Дону.
Работа поступила в редакцию 05.08.2014.