Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

THROMBOCYTOPENIA AT PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C, WHO ARE RECEIVING COMBINED ANTI-VIRUS THERAPY. THE SYMPTOMS, AND THE FEATURES OF PATHOGENESIS

Dontsov D.V. 1 Ambalov J.M. 1 Projdakov M.A. 1 Kovalenko A.P. 1 Usatkin A.V. 1 Levina L.D. 1
1 Rostov State Medical University
1153 KB
The patients with chronic hepatitis C, are receiving combined anti-virus therapy, have often the positive virological result. But some patients during the treatment can receive the development of adverse effects. A special place in this case occupies hematological syndromes. The development of these adverse effects depends on many factors. In this work we have studied some features of thrombocytopenia pathogenesis at patients with chronic hepatitis C, who receives combined anti-virus therapy. In this situation we executed special researches: automatic hematological analysis, electronic microscopy of blood cells, definition of level auto-antibodies against thrombocytes, concentration of human thrombopoetin, and the DNA polymorphism of MPL-gene. There were 228 patients, who were receiving combined anti-virus therapy of chronic hepatitis C, in this research. This work was made on base for the department of infections diseases Rostov State Medical University.
chronic hepatitis C
anti-virus therapy
thrombocytopenia
1. Adinolfi L.E., Giordano М.G., Аndгеаnа А. Hepatic fibrosis plays а central rоlе in the pathogenesis of thrombocytopenia in patients with chгonic viral hepatitis // Вr. Journal Наеmаtоlogy. – 2001. – Vol. 113. – pp. 590–595.
2. Afdhal N., McHutchison J., Brown R. Тhrombocytopenia associated with chronic liver disease // Journal Нераtоlogy. – 2008. – Vol. 48. – pp. 1000–1007.
3. Berry L., Irving W. Predictors of hepatitis C treatment response: what’s new? // Expert Review of Anti-infective Therapy. – 2014. – Vol. 12, no. 2. – pp. 183–191.
4. Flisiak R., Jaroszewicz J., Parfieniuk-Kowerda A. Emerging treatments for hepatitis C // Expert Opinion on Emerging Drugs. – 2013. – Vol. 18, no. 4. – pp. 461–475.
5. Hashemi N., Rossi S., Navarro V.J. Safety of peginterferon in the treatment of chronic hepatitis C // Expert Opinion on Drug Safety. – 2008. – Vol. 7, no. 6. – pp. 771–781.
6. Suarez A., Redmond D. Desired Social Distance From People Who Have Hepatitis C Virus: An Exploration Among Staff in Health Care, Dentistry, Drug Treatment, and Tattoo/Body Piercing // Substance Use & Misuse. – 2014. – Vol. 49, no. 4. – pp. 466–474.
7. Toyoda H., Kumada T. Pharmacotherapy of chronic hepatitis C virus infection – the IDEAL trial: ‘2b or not 2b (=2a), that is the question’ // Expert Opinion on Pharmacotherapy. – 2009. – Vol. 10, № 17. – pp. 2845–2857.

Хронический гепатит С (ХГС) является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека [6]. Применение современной комбинированной противовирусной терапии (КПТ) ХГС позволяет добиться у многих пациентов полной элиминации возбудителя [3, 4, 5], однако, актуальной проблемой при этом остается развитие нежелательных явлений (НЯ), среди которых особое место занимают гематологические осложнения [1, 7]. Одним из наиболее серьезных гематологических синдромов у больных ХГС является КПТ-ассоциированная тромбоцитопения, развитие которой значительно увеличивает риск возникновения состояний, угрожающих жизни пациентов [1, 2]. К сожалению, многие стороны патогенеза данного НЯ этиотропного лечения хронической HCV-инфекции остаются практически не изученными.

Цель исследования – детально изучить патогенез и клинические проявления КПТ-ассоциированной тромбоцитопении у больных ХГС.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 228 больных ХГС, имевших показания к КПТ. Генотип HCV 1a встречался у 3,5 %, 1b – 51,3 %, 3а – 28,9 % и 2а – 16,2 % человек. Уровень вирусной нагрузки (ВН) у 30,3 % пациентов составил < 3×105 МЕ/мл, у 46,1 % – 3×105 – 6×105 МЕ/мл и у 23,7 % > 6×105 МЕ/мл. Всем испытуемым была назначена КПТ согласно современным международным стандартам. 51,3 % пациентов получали рибавирин в сочетании с пегилированными α-интерферонами (пег-ИНФ-α), 48,7 % – в сочетании с «короткими». В ходе работы наблюдаемым лицам был выполнен ряд высокоспециализированных исследований. Определение показателей гемограммы проводилось методом автоматического гематологического анализа («Advia 2120i» (Siemens)) непосредственно перед началом КПТ, через 4, 8, 12, 24 и 48 (лица, инфицированные 1-м генотипом HCV) недель КПТ. Внутриклеточная ультраструктура тромбоцитов ПК изучалась с помощью трансмиссионной электронной микроскопии на просвечивающем электронном микроскопе «Tecnai G2 Spirit BioTWIN» (Philips, Нидерланды). Уровень человеческого тромбопоэтина (THPO) исследовали методом твердофазного ИФА с использованием набора реактивов Human Thrombopoietin Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, США) на спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США). Определение антител к поверхностным антигенам (GP IIa-IIIb) базальной мембраны тромбоцитов в сыворотке крови осуществляли путем постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции. При этом использовались диагностические наборы «Thrombocytes IIFT» (EUROIMMUN AG, Германия) с меченными ФИТЦ вторичными антителами к антитромбоцитарным IgG человека. Характер флуоресцентного свечения оценивался на микроскопе Olympus СХ41 (Япония). Результат реакции выражался в титрах. Перечисленные выше методы исследования проводились дважды: перед началом и сразу после завершения или вынужденного прекращения КПТ. Помимо этого у испытуемых лиц методом «ПЦР в реальном времени» было выполнено изучение однонуклеотидных ДНК-полиморфизмов (SNP) гена рецептора тромбопоэтина MPL, в частности частота точковых мутаций W515L/K (rs121913615/121913616). Для генотипирования SNP использовали аллель-специфичные зонды наборов реагентов «SNP-Скрин» (Синтол, РФ). Заключительным этапом явился тщательный статистический анализ полученных результатов, который был выполнен после полного завершения клинико-лабораторно-инструментального мониторинга всех пациентов.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного лечения УВО в общей сложности был достигнут у 155 (68,0 %) пациентов, из них 64 (41,3 %) были инфицированы 1-м; 34 (21,9 %) – 2-м и 57 (36,8 %) – 3-м генотипами HCV. Среди получавших пег-ИФН-α-2а (n = 117) частота УВО составила 54,7 % (n = 64); получавших «короткие» ИФН-α (n = 111) – 82,0 % (n = 91). У больных, инфицированных 1-м генотипом HCV (n = 125), УВО отмечался в 51,2 % (n = 64) случаев; у инфицированных 2-м (n = 37) и 3-м (n = 66) генотипами HCV – в 91,9 % (n = 34) и 86,4 % (n = 57) случаев соответственно. Проведение КПТ прекращалось при отсутствии через 12 недель лечения РВО и/или развитии у пациентов тяжелых НЯ противовирусной терапии. В итоге, из 228 больных ХГС полностью закончили курс КПТ 163 человека (71,5 %). У 8 пациентов (3,5 %) терапия была отменена уже через 8 недель лечения исключительно по причине развития тяжелых гематологических осложнений КПТ. У 57 больных ХГС (25,0 %) было зафиксировано отсутствие РВО, причем у 9 из них (3,9 %) параллельно наблюдалось развитие к 12-й неделе КПТ тяжелых осложнений со стороны системы крови, также требовавших отмены терапии.

При изучении степени тяжести КПТ-ассоциированной тромбоцитопении нами была использована классификация Всемирной организации здравоохранения, согласно которой выделяют легкую (Тр 150–75×109/л), умеренную (Тр 74–50×109/л) и тяжелую (Тр < 50×109/л) степени тромбоцитопении. В результате было установлено, что на разных этапах КПТ тромбоцитопения в общей сложности развилась у 30,3 % пациентов, при этом легкая степень отмечалась у 16,2 %; умеренная – у 10,5 % и тяжелая – у 3,5 % больных ХГС.

Объективные изменения в виде геморрагий в местах инъекций, появления петехиальной сыпи на нижних конечностях, частых носовых кровотечений, гематурии были выявлены исключительно у лиц с умеренной и тяжелой степенью тромбоцитопении. У 21,4 % пациентов, начиная с 20 недели КПТ, было зафиксировано развитие спленомегалии.

Легкая степень тромбоцитопении через 4 недели КПТ была зафиксирована у 8,3 %, через 8 недель – у 11,8 %, через 12 – у 15,0 %, через 24 – у 29,4 % и через 48 (пациенты с 1-м генотипом HCV) – у 34,8 % больных ХГС. Умеренная степень тромбоцитопении через 12 недель КПТ отмечалась у 1,4 % больных ХГС, через 24 недели – у 8,0 % и через 48 недель – у 11,1 % пациентов. Развитие тромбоцитопении тяжелой степени было выявлено у 3,6 % больных ХГС через 12 недель лечения, совпав при этом с отсутствием РВО у данной категории лиц (табл. 1).

Все участники исследования в зависимости от минимального количества тромбоцитов, зафиксированного у каждого пациента за весь период КПТ (Трmin), были разделены на три группы. В 1-ю группу (n = 159) вошли лица, у которых Трmin на протяжении КПТ оставался в пределах допустимой нормы, т.е. > 150×109/л. 2-я группа (n = 37) включала больных ХГС с легкой степенью КПТ-ассоциированной тромбоцитопении: Трmin в пределах 75–150×109/л. 3-ю группу (n = 32) составили лица с умеренной и тяжелой степенью тромбоцитопении: Трmin < 75×109/л. Средний показатель Трmin в 1-й группе оказался равен 176,03 ± 2,77; во 2-й – 127,89 ± 3,45 и в 3-й – 64,69 ± 2,03×109/л.

Проведенный корреляционный анализ позволил установить наличие умеренной обратной ассоциативной связи между Трmin и такими исходными показателями пациентов как возраст, индекс массы тела (ИМТ), величина ВН и индекс фиброза (ИФ), что же касается количества Тр перед началом КПТ, то в данном случае была получена сильная прямая ассоциативная связь (табл. 2).

Таблица 1

Характер распределения больных ХГС в зависимости от количества тромбоцитов перед началом КПТ, через 4, 8, 12, 24, 48 недель от начала КПТ и через 24 недели после окончания КПТ

Тр. (×109/л)

Абсолютное (n) и относительное (%) число больных ХГС

перед

КПТ (n = 228)

4 недели

КПТ

(n = 228)

8 недель

КПТ (n = 228)

12 недель

КПТ

(n = 220)

24 недели

КПТ

(n = 163)

48 недель

КПТ

(n = 72)

24 недели

после КПТ

(n = 221)

> 150

225

(98,7 %)

209

(91,7 %)

201

(88,2 %)

176

(80,0 %)

102

(62,6 %)

39

(54,1 %)

209

(94,6 %)

150–75

3

(1,3 %)

19

(8,3 %)

27

(11,8 %)

33

(15,0 %)

48

(29,4 %)

25

(34,8 %)

12

(5,4 %)

75–50

0

0

0

3

(1,4 %)

13

(8,0 %)

8

(11,1 %)

0

< 50

0

0

0

8

(3,6 %)

0

0

0

Таблица 2

Характер корреляционных связей Трmin с возрастом, ИМТ, количеством Тр, величиной ВН и ИФ перед КПТ у наблюдаемых нами больных ХГС

Исследуемый показатель

Возраст

пациентов

ИМТ

перед КПТ

Количество Тр перед КПТ

ВН

перед КПТ

ИФ

перед КПТ

r

p

r

p

r

p

r

p

r

р

Трmin

-0,28

< 0,01

-0,31

< 0,01

0,65

< 0,01

-0,35

< 0,01

-0,27

< 0,01

На старте КПТ среди пациентов 3-й группы в сравнении с 1-й и 2-й преобладали лица старше 40 лет, имеющие ИМТ > 25 и ИФ F2-3 (р < 0,05). Перед началом КПТ средний показатель количества Тр в 1-й группе больных ХГС составил 260,83 ± 3,96; во 2-й – 218,46 ± 5,73 и в 3-й – 180,78 ± 3,76 ×109/л (во всех случаях р > 0,05). Уже через 4 недели терапии отмечалось достоверное снижение среднего показателя количества Тр у пациентов всех групп (р > 0,05), минимальные же значения данного показателя были зафиксированы в период с 24-й по 48-ю недели КПТ. В целом же, наиболее выраженные изменения на всех этапах лечения отмечались в 3-й группе больных ХГС (р < 0,05). Что касается среднего объема Тр, то в процессе КПТ отмечалось статистически значимое (р < 0,05) повышение среднего показателя MPV, наиболее выраженного опять-таки у пациентов 3-й группы.

В ходе исследования во всех сравниваемых группах были выявлены пациенты с разнообразными структурными дефектами как цитоплазматической мембраны тромбоцитов (участки локального разрыхления, патологические выпячивания, микро- и макровезикулобразование), так и их стромы (образование полостей и эндовезикул, гипертрофия грануломера, отек и набухание митохондрий) (рис. 1, 2).

Как показал сравнительный анализ, на старте лечения в 3-й группе пациентов гораздо чаще встречались лица с вышеуказанными дефектами. После завершения КПТ удельный вес больных ХГС с выявленными структурными изменениями тромбоцитов либо имел тенденцию к снижению, либо достоверно снижался во всех группах (р < 0,05), оставаясь, тем не менее, наиболее высоким в 3-й группе.

Что касается уровня антитромбоцитарных антител, то в 1-й и 2-й группе пациентов перед началом КПТ были обнаружены лица с отсутствием, а также с низким и умеренным уровнем IgG к поверхностным антигенам GP IIa-IIIb, при этом существенных отличий их удельного веса между данными группами зафиксировано не было. В 3-й же группе больных ХГС статистически более высоким оказалось относительное количество пациентов с низким и умеренным уровнем антитромбоцитарных IgG. После КПТ в 1-й группе удельный вес пациентов с выявленным уровнем антитромбоцитарных IgG существенно не изменился, во 2-й – достоверно повысился удельный вес больных с умеренным, а в 3-й – с высоким уровнем антитромбоцитарных IgG, кроме того, в 3-й группе отмечалось появление пациентов с крайне высоким уровнем антитромбоцитарных IgG.

Средний показатель уровня THPO перед началом КПТ в 1-й группе наблюдаемых нами лиц составил 24,43 ± 1,1 пг/мл, во 2-й – 25,77 ± 0,97 пг/мл, в 3-й же группе данный показатель оказался достоверно выше – 29,08 ± 1,01 пг/мл (р < 0,05). После окончания КПТ средний уровень THPO статистически значимо повысился лишь в 1-й и 2-й группах, тем самым достоверно превысив таковой у пациентов 3-й группы.

don1.wmf

Рис. 1. Признаки деструкции плазмолеммы тромбоцитов, выявленные у наблюдаемых пациентов. Трансмиссионная электронная микроскопия: а – локальные участки истончения и разрыхления (×58 000); б – патологические выпячивания плазмолеммы (×22 000); в – образование микро- и макровезикул (×36 000)

don2.wmf

Рис. 2. Признаки деструкции цитоплазмы тромбоцитов, выявленные у наблюдаемых пациентов. Трансмиссионная электронная микроскопия: а – тромбоциты с множественными эндовезикулами (×22 000); б – гипертрофия грануломера (×44 000); в – отек и набухание митохондрий (×38 000)

Частота встречаемости точковой мутации W515L (rs121913615) гена MPL в 1-й группе больных ХГС составила 27,8 ± 7,5 % пациентов, во 2-й группе – 22,6 ± 7,5 % и наконец в 3-й – 71,9 ± 7,9 % человек, что оказалось значительно выше нежели у пациентов первых двух групп (р < 0,001). Совсем иная ситуация складывалась с мутацией W515K (rs121913616), в данном случае «мутантный» генотип был зафиксирован в 1-й и во 2-й группах больных ХГС в 16,7 ± 6,2 %, и 16,1 ± 6,6 % случаев соответственно (р > 0,05), в 3-й же группе данная мутация выявлена не была.

Выводы

  1. Степень выраженности КПТ-ассоциированной тромбоцитопении у больных ХГС определена целым рядом факторов, среди которых можно выделить как непосредственное действие HCV, так и индивидуальные характеристики самого пациента.
  2. Перед началом противовирусного лечения у больных ХГС имеются разнообразные ультраструктурные дефекты мембраны и стромы эритроцитов, которые, вполне возможно, могут играть важную роль в развитии КПТ-ассоциированной тромбоцитопении.
  3. В патогенезе КПТ-ассоциированной тромбоцитопении существенное место занимает повышение уровня антитромбоцитарных аутоантител к поверхностным антигенам GP IIa-IIIb.
  4. В процессе антивирусной терапии у лиц с отсутствием или же легкой степенью КПТ-ассоциированной тромбоцитопении происходит компенсаторное увеличение выработки эндогенного THPO, что вполне обеспечивает адекватный уровень тромбоцитопоэза у данной категории лиц.
  5. Развитие у больных ХГС средней и тяжелой степени КПТ-ассоциированной тромбоцитопении ассоциируется с высокой частотой точковой мутации W515L (rs121913615), происходящей в структуре гена MPL, ответственного, как известно, за синтез R эндогенного THPO.

Рецензенты:

Николаев Б.Ф., д.м.н., МЛПУЗ «ГБ № 1 им. Н.А. Семашко», г. Ростов-на-Дону;

Яговкин Э.А., д.м.н., Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии министерства здравоохранения РФ, г. Ростов-на-Дону.

Работа поступила в редакцию 07.08.2014.