По международным стандартам, биологически активные добавки (БАД) – это природные (идентичные природным) биологически активные вещества, предназначенные для употребления одновременно с пищей или введения в состав пищевых продуктов.Разработанная в Северо-Восточном федеральном университете биологически активная добавка к пище «Ягель Детокс» из таллома лишайников используется как дополнительный источник полисахаридов, витамина В12, содержит лишайниковые кислоты антибиотическогодействия [5–8]. Производство БАД осуществляется инновационной экологически чистой, безотходной механохимической биотехнологией [1, 2, 9].
Уникальная технология обработки сырья позволяет получить межмолекулярные комплексы на основе полимерной матрицы природных олигосахаридов. Полученные комплексы состоят из «активного наполнителя» – лишайниковых β-олигосахаридов, образующихся в процессе механохимической переработки лишайниковых β-полисахаридов, и действующего вещества любой природы, в том числе, вносимых извне фармацевтических препаратов антибиотического, адаптагенного, иммуномодуляторного, цитостатического действия и витаминно-микроэлементных комплексов [3, 4]. В этой связи нами ведется планомерная работа для регистрации БАД как фармацевтического средства. Надлежащей практикой оценки применимости новых фармакологических веществ являются испытания безопасности их использования.
Целью исследования является определение безопасности и потенциальных токсических эффектов биологически активной добавки к пище «Ягель Детокс».
Материалы и методы исследований
Экспертиза образцов БАД к пище «Ягель Детокс» по показателям безопасности проводилась в аккредитованном испытательном лабораторном центре на основании нормативных и методических документов Государственной системы санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации с учетом требований Европейской конвенции по защите позвоночных животных, требований национального руководства и руководства учреждения по содержанию и использованию лабораторных животных.
Токсичность БАД изучали согласно требованиями к доклиническому изучению общетоксического действия фармакологических веществ [10, 11]. Животные Mussp. СD-1 (n=60 самок и n = 60 самцов) предоставлены Питомником лабораторных животных ФИБХ РАН г. Пущино в возрасте 7 недель и массой тела33,0 ± 0,6 г (самцы) и 25,4 ± 0,5 г (самки). Тестируемый препарат «Ягель Детокс» и контрольное вещество (физ. раствор) вводились животным внутрижелудочно объемом 10 мл/кг в двух различных дозах 1000 и 2000 мг/кг.
В ходе прижизненной фазы исследования у животных регистрировались клинические признаки возможной интоксикации, вес тела, потребление корма. Половина животных была подвергнута эвтаназии через две недели после начала введения тестируемых препаратов. Вторая половина была подвергнута эвтаназии через 8 недель после начала введения тестируемых препаратов. У животных были выполнены измерения гематологических показателей периферической крови, биохимический анализ сыворотки крови, массы органов. В рамках данного исследования гистологический анализ не потребовался.
Для всех количественных данных была применена описательная статистика: подсчитаны средние значения и стандартная ошибка среднего. Нормальность распределения вариант в группе определяли тестом Shapiro-Wilk при 5 %-ном уровне значимости. Данные веса тела и потребления корма были проанализированы двухфакторным дисперсионным анализом ANOVA с последующим тестом Newman-Keuls или Duncan. Данные гематологии, биохимии и веса органов были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим тестом Newman-Keuls или непараметрического критерия Kruskal-Wallis с последующим тестом Dunn в зависимости от типа распределения количественных данных.
Статистический анализ проводили программой Statisticaver. 7.1. Различия определяли при P < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
По результатам определения микробиологических исследований БАД к пище было установлено отсутствие патогенной микрофлоры во всех пробах, что свидетельствует о высокой степени микробиологической чистоты биопродукции. Также по обследованным показателям токсичных элементов и пестицидов биопрепарат соответствует нормативам, установленным для БАД (СанПиН 2.3.2.1290-03).
В ходе токсикологического исследования признаков интоксикации организма животных не отмечено, случаи летальных исходов отсутствовали. Статистически значимых различий между животными, получавшими тестируемые препараты, и контрольными животными, получавшими физиологический раствор, по массе тела и ее приросту ни у самцов, ни у самок выявлено не было.
После введения тестируемых препаратов у мышей не наблюдалось выраженных изменений биохимических показателей сыворотки крови, которые могли бы свидетельствовать о токсических изменениях во внутренних органах (табл. 1).
Таблица 1
Биохимические показатели крови животных (самки, n = 60)
|
Биохимический параметр |
Срок эвтаназии, день |
Значение биохимического параметра/препарат |
||
|
Контроль (физ. раствор) |
Ягель Детокс, доза 1 (1000 мг/кг) |
Ягель Детокс, доза 2 (2000 мг/кг) |
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Мочевина, ммоль/л |
15-й |
10,1 ± 3,6 |
8,6 ± 1,5 |
8,3 ± 1,3 |
|
60-й |
8,4 ± 2,9 |
10,2 ± 3,7 |
9,1 ± 2,4 |
|
|
Холестерин, ммоль/л |
15-й |
2,4 ± 0,5 |
2,5 ± 0,3 |
2,6 ± 0,7 |
|
60-й |
3,2 ± 1,4 |
2,9 ± 0,9 |
3,1 ± 0,9 |
|
|
Триглицериды, ммоль/л |
15-й |
0,7 ± 0,3 |
0,8 ± 0,3 |
0,6 ± 0,2 |
|
60-й |
0,8 ± 0,2 |
0,7 ± 0,4 |
0,8 ± 0,3 |
|
|
АЛТ, Ед/л |
15-й |
35,1 ± 14,3 |
26,0 ± 3,8 |
32,0 ± 3,4 |
|
60-й |
27,9 ± 12,7 |
31,5 ± 4,6 |
30,8 ± 2,3 |
|
|
АСТ, Ед/л |
15-й |
86,8 ± 34,1 |
59,4 ± 9,4 |
73,8 ± 31,0 |
|
60-й |
67,5 ± 24,8 |
63,2 ± 19,0 |
72,9 ± 32,1 |
|
|
Билирубин, мкмоль/л |
15-й |
3,8 ± 1,9 |
4,7 ± 1,1 |
4,8 ± 1,5 |
|
60-й |
4,1 ± 2,0 |
3,9 ± 2,5 |
4,6 ± 1,7 |
|
|
Креатинин, мкмоль/л |
15-й |
63,3 ± 14,0 |
53,0 ± 16,4 |
56,6 ± 8,5 |
|
60-й |
57,8 ± 9,1 |
61,2 ± 19,3 |
55,4 ± 7,2 |
|
|
ЩФ, Ед/л |
15-й |
119,0 ± 22,3 |
100,4 ± 22,9 |
114,9 ± 35,5 |
|
60-й |
115,3 ± 12,6 |
107,9 ± 21,4 |
116,5 ± 27,7 |
|
|
Альбумин, г/л |
15-й |
32,9 ± 2,1 |
31,8 ± 1,7 |
31,9 ± 2,1 |
|
60-й |
33,5 ± 3,0 |
34,2 ± 2,8 |
32,5 ± 3,1 |
|
|
Кальций, ммоль/л |
15-й |
2,5 ± 0,2 |
2,4 ± 0,05 |
2,4 ± 0,1 |
|
60-й |
2,4 ± 0,1 |
2,7 ± 0,8 |
2,6 ± 0,3 |
|
|
Фосфор, ммоль/л |
15-й |
3,8 ± 1,0 |
3,4 ± 0,5 |
3,3 ± 0,2 |
|
60-й |
3,5 ± 2,0 |
3,3 ± 0,7 |
3,4 ± 0,1 |
|
|
Общий белок, г/л |
15-й |
45,3 ± 2,9 |
43,7 ± 2,6 |
44,0 ± 3,6 |
|
60-й |
41,9 ± 3,0 |
44,6 ± 1,9 |
45,6 ± 2,1 |
|
|
Глобулины, г/л |
15-й |
12,4 ± 1,2 |
11,9 ± 1,2 |
12,1 ± 1,7 |
|
60-й |
12,8 ± 1,3 |
10,9 ± 2,0 |
12,8 ± 2,6 |
|
Результаты гематологического анализа показали, что внутрижелудочное введение тестируемого препарата «Ягель Детокс» мышам CD-1 не выявило токсических эффектов на систему крови (табл. 2).
Таблица 2
Гематологические показатели животных (самки, n = 60)
|
Параметр |
Срок эвтаназии, день |
Значение параметров гематограммы / препарат |
|||||
|
физ. раствор |
Ягель Детокс, доза 1 (1000 мг/кг) |
Ягель Детокс, доза 2 (2000 мг/кг) |
|||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|||
|
Количество лейкоцитов (WBC), г/л |
15-й |
3,2 ± 1,2 |
4,0 ± 1,9 |
3,3 ± 1,0 |
|||
|
60-й |
3,9 ± 0,9 |
3,5 ± 1,6 |
3,8 ± 1,4 |
||||
|
Количество эритроцитов (RBC), т/л |
15-й |
9,16 ± 0,12 |
10,02 ± 0,36 |
9,18 ± 0,49 |
|||
|
60-й |
10,29 ± 0,26 |
9,45 ± 0,74 |
9,97 ± 0,68 |
||||
|
Уровень гемоглобина (Hb), г/л |
15-й |
152 ± 3 |
138 ± 4 |
129 ± 5 |
|||
|
60-й |
147 ± 7 |
129 ± 6 |
135 ± 4 |
||||
|
Гематокрит (HCT), л/л |
15-й |
0,482 ± 0,024 |
0,457 ± 0,037 |
0,457 ± 0,023 |
|||
|
60-й |
0,471 ± 0,035 |
0,445 ± 0,062 |
0,439 ± 0,027 |
||||
|
Средний объем эритроцита (MCV), фл |
15-й |
51,8 ± 0,2 |
51,4 ± 0,4 |
49,9 ± 3,6 |
|||
|
60-й |
50,3 ± 0,4 |
52,1 ± 0,9 |
49,7 ± 2,2 |
||||
|
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC), г/л |
15-й |
316 ± 0,1 |
307 ± 0,4 |
282 ± 12 |
|||
|
60-й |
293 ± 0,5 |
314 ± 0,2 |
301 ± 4 |
||||
|
Количество тромбоцитов (PLT), г/л |
15-й |
816 ± 0,12 |
902 ± 0,36 |
854 ± 185 |
|||
|
60-й |
875 ± 23 |
892 ± 35 |
868 ± 119 |
||||
|
Средний объем тромбоцитов (MРV), фл |
15-й |
5,2 ±0,3 |
4,8 ± 0,4 |
4,9 ± 0,2 |
|||
|
60-й |
4,9 ± 0,2 |
5,0 ± 0,3 |
5,1 ± 0,3 |
||||
|
Тромбокрит (PCT), сл/л |
15-й |
0,489 ± 0,023 |
0,517 ± 0,073 |
0,393 ± 0,076 |
|||
|
60-й |
0,457 ± 0,038 |
0,522 ± 0,069 |
0,420 ± 0,034 |
||||
|
Широта распределения тромбоцитов по объему,% |
15-й |
11,8 ± 0,2 |
11,4 ± 0,4 |
10,7 ± 1,3 |
|||
|
60-й |
11,5 ± 0,3 |
11,6 ± 0,7 |
11,8 ± 1,4 |
||||
|
Лейкограмма |
|||||||
|
Нейтрофилы палочкоядерные, г/л |
15-й |
0,02 ± 0,02 |
0,01 ± 0,01 |
0,02 ± 0,04 |
|||
|
60-й |
0,01 ± 0,03 |
0,02 ± 0,02 |
0,03 ± 0,05 |
||||
|
Нейтрофилы сегментоядерные, г/л |
15-й |
1,50 ± 0,27 |
2,06 ± 0,40 |
0,30 ± 0,16 |
|||
|
60-й |
1,44 ± 0,35 |
1,86 ± 0,84 |
0,32 ± 0,17 |
||||
|
Эозинофилы, г/л |
15-й |
0,07 ± 0,04 |
0,11 ± 0,05 |
0,03 ± 0,02 |
|||
|
60-й |
0,09 ± 0,03 |
0,05 ± 0,04 |
0,08 ± 0,02 |
||||
|
Базофилы, г/л |
15-й |
0,00 ± 0,00 |
0,00 ± 0,00 |
0,00 ± 0,00 |
|||
|
60-й |
0,00 ± 0,00 |
0,00 ± 0,00 |
0,00 ± 0,00 |
||||
|
Лимфоциты, г/л |
15-й |
5,63 ± 1,30 |
6,76 ± 1,52 |
2,90 ± 0,81 |
|||
|
60-й |
4,45 ± 1,60 |
5,19 ± 1,43 |
3,22 ± 0,64 |
||||
|
Моноциты, г/л |
15-й |
0,02 ± 0,02 |
0,08 ± 0,07 |
0,04 ± 0,01 |
|||
|
60-й |
0,06 ± 0,03 |
0,05 ± 0,04 |
0,08 ± 0,02 |
||||
Статистически значимых различий по массе органов между группами животных, получавших тестируемые препараты, и контрольными животными в ходе исследования также выявлено не было (табл. 3).Данные в табл. 1 – 3 приведены для самок, у самцов результаты аналогичны.
Таблица 3
Масса органов животных (самки, n = 60)
|
Орган |
Срок эвтаназии, день |
Масса органов, г/препарат |
||
|
Контроль (физ. раствор) |
Ягель Детокс, доза 1 (1000 мг/кг) |
Ягель Детокс, доза 2 (2000 мг/кг) |
||
|
Семенники/ яичники |
15-й |
0,0217 ± 0,001 |
0,021 ± 0,001 |
0,0232 ± 0,001 |
|
60-й |
0,0199 ± 0,001 |
0,0223 ± 0,001 |
0,0211 ± 0,001 |
|
|
Селезенка |
15-й |
0,1028 ± 0,008 |
0,1118 ± 0,01 |
0,112 ± 0,008 |
|
60-й |
0,1048 ± 0,01 |
0,1250 ± 0,012 |
0,1095 ± 0,01 |
|
|
Почки |
15-й |
0,3460 ± 0,02 |
0,3292 ± 0,01 |
0,3353 ± 0,02 |
|
60-й |
0,3542 ± 0,04 |
0,3485 ± 0,08 |
0,3352 ± 0,06 |
|
|
Надпочечники |
15-й |
0,0091 ± 0,001 |
0,0103 ± 0,001 |
0,0123 ± 0,001 |
|
60-й |
0,0110 ± 0,001 |
0,0099 ± 0,001 |
0,0110 ± 0,001 |
|
|
Печень |
15-й |
1,1994 ± 0,03 |
1,1354 ± 0,03 |
1,1868 ± 0,03 |
|
60-й |
1,1761 ± 0,06 |
1,1494 ± 0,05 |
1,1645 ± 0,04 |
|
|
Тимус |
15-й |
0,0491 ± 0,004 |
0,0512 ± 0,008 |
0,0468 ± 0,004 |
|
60-й |
0,0468 ± 0,005 |
0,0495 ± 0,01 |
0,0501 ± 0,03 |
|
|
Сердце |
15-й |
0,1297 ± 0,005 |
0,123 ± 0,003 |
0,1247 ± 0,005 |
|
60-й |
0,1315 ± 0,009 |
0,1286 ± 0,007 |
0,1252 ± 0,006 |
|
|
Легкие |
15-й |
0,1653 ± 0,01 |
0,1658 ± 0,005 |
0,1578 ± 0,01 |
|
60-й |
0,1722 ± 0,009 |
0,1684 ± 0,007 |
0,1595 ± 0,015 |
|
При плановой некропсии животных в ходе визуального осмотра внешнего состояния тела, внутренних поверхностей и проходов, полости черепа, грудной, брюшной и тазовой полостей с находящимися в них органами и тканями, шеи с органами и тканями, каркаса и скелетно-мышечной системы, а также мест введения морфологических признаков отклонений от общепринятой нормы, связанных с действием исследуемых препаратов, выявлено не было.
Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать заключение о том, что тестируемый препарат «Ягель Детокс «прошел токсиколого-гигиеническую экспертизу и может быть рекомендован для проведения дальнейших доклинических испытаний.
Рецензенты:
Кершенгольц Б.М., д.б.н., профессор, зам. директора по науке Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, г. Якутск;
Борисова Н.В., д.м.н., зам. директора по учебной работе Медицинского института ФГАОУ ВПО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова», г. Якутск.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.