Вирусы гриппа типа В, впервые выделенные в 1940 году, в течение длительного времени составляли одну весьма гетерогенную группу возбудителей. В начале 1980-х гг. наметился дивергентный характер их эволюции с формированием двух эволюционных линий, родоначальниками которых были признаны референс-вирусы В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88 [8], резко различающиеся по антигенным и генетическим свойствам и периодически (в разные эпидемические сезоны) сменяющие друг друга в циркуляции, что создает серьезные трудности при выборе штаммов для включения в состав гриппозных вакцин [2]. Установлено [7], что в результате естественного иммунопрессинга в пределах линий происходит постоянный антигенный дрейф, обусловленный мутациями в тяжелой субъединице гемагглютинина. По современным представлениям, Викторианская эволюционная линия разделилась далее на две генетически независимые сублинии, а Ямагатская – на четыре сублинии [7]. Информацию о механизмах антигенного дрейфа получают путем сравнения аминокислотного состава гемагглютинина природных изолятов и эскейп-мутантов, получаемых в лабораторных условиях в результате клонирования вирусов в присутствии моноклональных антител. Наблюдаемые в ходе естественной эволюции аминокислотные замены локализованы преимущественно в определенных локусах HA1, представляющих антигенные эпитопы этого белка. Интересно, что в этих же участках обычно происходят аминокислотные замены и у полученных в лабораторных условиях ЭМ.
В задачу настоящего исследования входила разработка моноклональных антител (МКА), направленных к HA1 вирусов гриппа ВЯ магатской линии с последующим получением эскейп–мутантов вируса и идентификацией иммунодоминантных эпитопов в составе молекулы гемагглютинина.
Материалы и методы исследований
Получение генетически стабильных штаммов мышиных гибридов – продуцентов моноклональных антител к вирусам гриппа.
МКА к вирусам гриппа типа В (штаммы В/Панама/45/90 и В/Флорида/04/06)были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа по методу [4] в следующей модификации. Мышей линии BALB/c иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 70 мкг антигена вирусов гриппа В/Панама/45/90 или В/Флорида/04/06, очищенных ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Двенадцать недель спустя мыши были бустированы очищенной фракцией поверхностных гликопротеинов (15 мкг/мышь) тех же вирусов. Через 3 дня после бустер-иммунизации проводили гибридизацию спленоцитов иммунных мышей с клетками мышиной миеломы линии PxAg. 653 в соотношении 10:1 в присутствии 50% раствора полиэтиленгликоля-2000 в среде Игла D-MEM. Клонирование гибридом проводили методом предельных разведений. Первичный отбор клонов проводили в ИФА с использованием для сенсибилизации планшет фракции поверхностных гликопротеинов вируса с последующим поэтапным внесением исследуемых культуральных жидкостей и затем – пероксидазных конъюгатоваффинно очищенных антител к IgG мыши, разведенных 1:10 000 (Sigma). Отобранные клоны гибридом, культивируемые на селективной среде НАТ, подвергали 5- кратному реклонированию, чередующемуся с размножением отобранных клонов в 24-луночных планшетах. Стабильные клоны – продуценты МКА – подвергали криоконсервации, а также использовали для получения асцитов путем внутрибрюшинного введения клонированных гибридом мышам линии BALB/c предварительно праймированных пристаном (Sigma).Селекция эскейп-мутантов.
В целях получения ЭМ использовали ранее описанный метод клонирования вирусов гриппа в присутствии нейтрализующих вирус МКА [3]. Для этого вирусы дикого типа (В/Панама/45/90 или В/Флорида/04/06) смешивали с равными количествами взятых в избыточной концентрации специфических МКА к указанным вирусам. Смеси инкубировали 1 ч при 37 0С, после чего вводили в куриные эмбрионы. Через 72 часа аллантоисные жидкости собирали и исследовали в РГА. Пробы, обладающие гемагглютинирующей активностью, содержащие ЭМ вируса, подвергали повторному клонированию, после чего собирали отдельные клоны и исследовали способность реагировать в РТГА с гомологичными и гетерологичными МКА.
Реакции гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютинации (РТГА) проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ. За титр гемагглютининов принимали наибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов. При постановке РТГА МКА титровали в объеме 50 мкл на 0,1М ФСБ, после чего вносили 50 мкл вирусной суспензии, содержащей 4 ГАЕ вируса. После инкубации смеси при комнатной температуре в течение часа вносили по 100 мкл 1 % суспензии куриных эритроцитов. Титром антител считали наибольшее разведение МКА, при котором наблюдалась полнаяингибиция гемагглютинации.
Молекулярно-генетический анализ
Выделение РНК вирусов гриппа В осуществляли с помощью набора QIAampViralRNAMiniKit («Qiagen»). Обратную транскрипцию РНК проводили в течение 40 мин. при 37 0С со случайными гексамерными праймерами с применением коммерческого набора «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия). Для амплификации использовали полимеразу ДиаТак («Интерлабсервис», Россия). Прямое секвенирование выполняли с помощью набора BigDyeTerninatorv3.1 CycleSequencingKit («AppliedBiosystems», США) с применением генетического анализатора GA3130 («AppliedBiosystems», США).
Результаты исследований и их обсуждение
Характеристика МКА, использованных в исследовании
В целях идентификации вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа типа В Ямагатской эволюционной линии (ЭЛ) нами была разработана панель из шести МКА к вирусам гриппа, в т.ч. два – к вирусу В/Панама/45/90 (МКА 4Н7 и D9) и четыре – к штамму В/Флорида/04/06 (МКА 8Н3, 8Н11, 9А3 и 10F4). Согласно данным western-блота все МКА были направлены к тяжелой субъединице НА1. Все полученные МКА реагировали до высоких титров в ИФА (10-6) с вирусами Ямагатской ЭЛ, при полном отсутствии взаимодействия с вирусами гриппа В Викторианской ЭЛ и штаммами ранних (1954-1983 гг.) лет выделения. МКА, полученные к Ямагатским штаммам, обладали выраженной антигемагглютинирующей активностью только в отношении вирусов, принадлежащих этой ветви, начиная с эталонного штамма В/Ямагата/16/88.Интересным исключением явились МКА 10F4, которые не взаимодействовали с ранними штаммами Ямагатской линии (1988–1998 гг. выделения), но реагировали в РТГА со штаммами 2004-2012 гг. выделения, антигенно родственными штамму B/Флорида/07/04. Все разработанные МКА не проявляли антигемагглютинирующей активности в отношении вирусов 1954 – 1983 гг. выделения и Викторианских изолятов (табл. 1). Разработанные МКА обладали выраженной вируснейтрализующей активностью, что обеспечило в дальнейшем возможность получения ЭМ вирусов.
Таблица 1
Взаимодействие моноклональных антител 4Н7, 8Н3, 8Н11, 9А3 и 10F4 (Ямагатские клоны) с различными штаммами вируса гриппа типа Вв РТГА
|
Эволюционная линия |
Штамм |
Титр МКА в РТГА* |
||||||
|
4Н7 |
8Н3 |
8Н11 |
9А3 |
10F4 |
||||
|
Штаммы ранних лет выделения |
B/Грэйт Лэйк/54 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
||
|
B/Сингапур/222/79 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
|||
|
B/СССР/100/83 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
|||
|
Штаммы Ямагатской эволюционной линии |
B/Ямагата/16/88 |
10240 |
10240 |
80 |
2560 |
<20 |
||
|
B/Панама/45/90 |
20480 |
20480 |
160 |
10240 |
<20 |
|||
|
B/Пекин/184/93 |
20480 |
20 |
160 |
80 |
<20 |
|||
|
B/Харбин/07/94 |
20480 |
20480 |
160 |
10240 |
<20 |
|||
|
B/Санкт-Петербург/210/95 |
20480 |
160 |
320 |
320 |
<20 |
|||
|
B/Липецк/3/97 |
20480 |
640 |
<20 |
320 |
<20 |
|||
|
B/Н.Новгород/348/97 |
20480 |
20480 |
40 |
1280 |
<20 |
|||
|
B/Яманаши/166/98 |
5120 |
20480 |
<20 |
2560 |
<20 |
|||
|
B/Флорида/07/04 |
20480 |
20480 |
160 |
5120 |
320 |
|||
|
B/ Флорида /04/06 |
20480 |
20480 |
160 |
5120 |
320 |
|||
|
В/Бангладеш/3333/07 |
20480 |
20480 |
160 |
5120 |
320 |
|||
|
В/Массачусетс/2/12 |
20480 |
20480 |
80 |
2560 |
160 |
|||
|
Штаммы Викторианской эволюционной линии |
B/ Пекин /243/97 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
||
|
B/Шандонг/07/97 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
|||
|
B/Шига/51/98 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
|||
|
B/Малайзия/2506/04 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
|||
|
B/Брисбэйн/60/08 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
<20 |
|||
*Примечание. приведены обратные величины титров
Выявление вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа В/Панама/45/90 и В/Флорида/04/06
Известно, что получение ЭМ, резистентных к действию вируснейтрализующих МКА, является ценным инструментом в изучении изменчивости антигенной структуры гемагглютинина и идентификации иммунодоминантных эпитопов в составе HA1. Использование МКА позволяет определить, является ли антигенная детерминанта вирусного белка, с которой они взаимодействуют, индуктором синтеза вируснейтрализующих антител (АТ). Полученные с использованием МКА ЭМ имеют, как правило, одну или две, реже три нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные замены. При этом в РТГА у ЭМ в сравнении с исходным вирусом наблюдается 8-32х-кратное и более снижение титров при взаимодействии с МКА, использованными для селекции. Нами был получен ряд ЭМ, полностью резистентных к вируснейтрализующему действию соответствующих МКА.
В настоящее время в молекуле гемагглютинина вируса гриппа В выделяют четыре антигенно значимых домена – петля 120 и прилегающие регионы HA1 (116 – 137), петля 150 HA1 (141 – 150), петля 160 HA1 (162 – 167), а также спираль 190 HA1 (194 – 202) и окружающие ее области [10]. Установлено, что эта молекула содержит шесть антигенных сайтов: BA, BB1, BB2, BC, BD и ВЕ [9].
Было показано, что ЭМ 4Н7, полученный к вирусу гриппа B/Панама/45/90, имел две аминокислотные замены в положениях 75 (Т75I) и 150 (D150T). Представляет интерес, что эти аминокислотные остатки находятся в различных функциональных областях гемагглютинина вируса гриппа В – сайтах ВЕ и ВА, соответственно [9]. По данным Nakagawa и соавторов [5], ряд ЭМ вируса гриппа В, штамм В/Кобе/28/2003, также имели двойные аминокислотные замены в молекуле НА1, при этом, ЭМ В/Кобе/28/2003–V4 имел замены в положениях 75 и 116, что соответствует сайтам ВЕ и ВС, т.е. изоляция ЭМ под иммунопрессом одного из МКА может приводить к появлению вариантов с АК заменами в двух различных антигенных сайтах. Другой ЭМ (ЭМ D9), полученный нами из штамма B/ Панама/45/90, имел одиночную аминокислотную замену в положении 149 (R149I), что соответствует антигенному сайту ВА. Анализ ЭМ 8Н3, 8Н11, 9А3 и 10F4, полученных к вирусу B/Флорида/04/06, показал, что эти варианты ЭМ имели также одиночные аминокислотные замены в положениях N 202 K (спираль 190), 85 (H→Y), S 242 R (петля 240) и 40 (Y→H) соответственно.
Пространственная трехмерная модель локализации иммунодоминантных эпитопов в молекуле НА1 построена нами на основе идентификации изменчивых эпитопов в составе ЭМ и опубликованных данных по кристаллической структуре молекулы НА вируса гриппа B/Яманаши/166/98, PDBcode: 4М40 [6], с использованием программы RasMol, версия 2.7.4.2. Идентифицированы замены АК в НА1 в позициях 75 (Т→I) и 150 (D→T) в ЭМ 4Н7 и 149 (R→I) ЭМ D9 вируса гриппа B/Панама/45/90. Кроме того, локализованы АК замены в положениях 202 (N→K), 85 (H→Y), 242 (S→R) и 40 (Y→H) у ЭМ вируса гриппа B/Флорида/04/06.
Локализация аминокислотных замен в молекуле НА1эскейп-мутантов вируса гриппа B/Флорида/04/06 Ямагатской линии
Влияние аминокислотных замен в составе гемагглютинина ЭМ вирусов гриппа В на характер взаимодействия с МКА
Для определения влияния аминокислотных замен в молекуле HA на характер реагирования со специфическими антителами в перекрестной РТГА изучено взаимодействие полученных ЭМ с различными МКА к вирусам гриппа В Ямагатской линии (табл. 2).
Таблица 2
Взаимодействие эскейп-мутантов 4Н7, D9, 8Н3, 8Н11, 9А3 и 10F4 с гомологичными и гетерологичными моноклональными антителами в РТГА
|
Штаммы и ЕМ вирусов гриппа |
Титр МКА в РТГА* |
АК замены |
||||
|
4Н7 |
8Н3 |
8Н11 |
9А3 |
10F4 |
||
|
B/Панама/45/90 |
20480 |
20480 |
160 |
10240 |
<20 |
нет (дикий тип) |
|
B/Флорида/04/06 |
20480 |
20480 |
160 |
5120 |
320 |
нет (дикий тип) |
|
ЭМ 4Н7 |
<20 |
20480 |
160 |
2560 |
80 |
N75I, D150T |
|
ЭM 8H3 |
20480 |
20 |
80 |
2560 |
160 |
N202K |
|
ЭM 8H11 |
20480 |
20480 |
<20 |
2560 |
160 |
H85Y |
|
ЭM 9A3 |
20480 |
<20 |
80 |
<20 |
160 |
S242R |
|
ЭM 10F4 |
20480 |
20480 |
160 |
2560 |
<20 |
Y40H |
|
ЭМ D9 |
20480 |
20480 |
160 |
5120 |
<20 |
R149I |
*Примечание —приведены обратные величины титров
Установлено, что все полученные ЭМ полностью утратили способность к взаимодействию с гомологичными МКА, использованными для селекции. Кроме того, ЭМ 8Н3, 8Н11 и 10F4 не проявили каких-либо особенностей взаимодействия с гетерологичными МКА по сравнению со штаммами дикого типа (титр в РТГА 1-1/2). ЭМ D9, как и штамм B/Панама/45/90, использованный для селекции, не реагировали с МКА 10F4. Это можно объяснить тем, что МКА 10F4 получены к вирусу B/Флорида/04/06, имеющему в HА в положении 40 тирозин, тогда как B/Панама/45/90 имеет в этой позиции гистидин. Этим же объясняется отсутствие взаимодействия МКА 10F4 с другими штаммами Ямагатской ветви 1990-х годов выделения (табл. 1). Тем более интересен тот факт, что ЭМ 4Н7 (исходный вирус B/Панама/45/90), напротив, стал взаимодействовать с МКА 10F4. ЭМ 4Н7 имеет 2 аминокислотные замены (Т75I, D150T), и, видимо, одна из этих замен имеет компенсаторный характер во взаимодействии с МКА 10F4 или же это проявляется в их совокупной замене. ЭМ 9А3 (замена S242R), кроме резистентности к гомологичным МКА, перестал взаимодействовать с МКА 8Н3, тогда как ЭМ 8Н3 (замена N202K) взаимодействовал с МКА 9А3 до полного титра, т.е. в данном случае сохранилось только одностороннее антигенное родство. Вероятно, это связано с тем, что аминокислотные остатки в положениях 202 и 242 входят в спираль 190 и петлю 240, они расположены в мембранно-дистальном конце молекулы НА и включены в состав рецептор-связывающего кармана вируса гриппа В. Переориентация боковых цепей в петле 240 может сильно изменять антигенные свойства этого региона [6]. Кроме того, МКА 8Н3 и 9А3 проявили сходную тенденцию при взаимодействии в РТГА с набором эталонных и отечественных изолятов – значимое снижение титров со штаммами B/Пекин/184/93, B/Санкт Петербург/210/95 и B/Липецк/3/97 (табл. 1)
Заключение
Таким образом, выполненные исследования дали возможность четко локализовать иммунодоминантные эпитопы в составе молекулы гемагглютинина вирусов гриппа В Ямагатской линии, ответственные за выработку вируснейтрализующих антител. Один из полученных ЭМ (ЭМ 4Н7) имел две аминокислотные замены Т75I и D150T, соответствующие сайтам ВЕ и ВА, ЭМ D9 – одиночную замену R149I – сайт ВА, ЭМ 8Н3 – замену N202K, входящую в спираль 190 и рецептор–связывающий карман молекулы НА1. ЭМ 10F4 имел одиночную замену в положении 40 (Y→H), которая по современной классификации не входит ни в один из антигенных сайтов, но часто встречается у полевых изолятов [1]. ЭМ 8Н11 и 9А3 имели одиночные аминокислотные замены в положениях 85 (H→Y) и 242 (S→R) соответственно. Замены в этих положениях ранее описаны не были, что расширяет представления об антигенно значимых детерминантах в составе гемагглютинина вируса гриппа типа В.
Рецензенты:
Жилинская И.Н., д.б.н., вед.науч. сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург;
Киселева И.В., д.б.н., доцент, рук.лаборатории вакцинных штаммов отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева, ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.