Гормон пинеальной железы мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин) принято называть таймер-гормоном, поскольку в продолжительности и амплитуде его секреции «закодирована» информация о длине светового дня, что позволяет ему играть одну из главных ролей в регуляции большинства суточных и сезонных адаптаций в организме млекопитающих [6, 8]. Наряду с этим эффекты мелатонина в периферических тканях характеризуются широкой функциональной плейотропией [4]. Особый интерес вызывает действие гормона на про- и антиоксидантный статус у различных видов млекопитающих, поскольку изучение антиокислительных способностей мелатонина проводилось в основном на лабораторных животных, утративших за период долгого разведения в неволе многие черты своих диких предковых видов [4, 10].
Объектами нашего исследования явились фермерские лисицы и песцы, сохранившие присущую их диким сородичам сезонность физиологических функций. Это близкородственные виды, принадлежащие к одному семейству Canidae, но различающиеся географическими ареалами распространения: песец узкоспециализирован к суровым условиям высоких широт, тогда как лисица – обитатель преимущественно умеренных широт. Животных разводят в неволе для получения ценного зимнего меха. Для его ускоренного созревания часто применяют имплантируемый препарат мелатонина [9].
Цель исследования – провести сравнительно-видовой анализ реакции АОФ и системы генерации АФК в печени песцов и лисиц на имплантат мелатонина.
Материалы и методы исследований
Объекты исследования: вуалевый песец (Alopex lagopus L.), серебристо-чёрная лисица (Vulpes vulpes L.). Животные каждого вида (n = 10, половозрелые самки в возрасте 2-5 лет) были разделены на 2 равноценные группы. Особям подопытных групп в июне подкожно был имплантирован препарат, содержащий 11,2 мг мелатонина для песцов, 12 мг – для лисиц. Контрольным особям имплантация проведена не была. Образцы печени отбирали в период планового забоя, замораживали и хранили при – 25 °C до проведения анализа.
Гомогенаты печени готовили в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,0). После центрифугирования при 6000g в течение 15 мин в полученных супернатантах проанализированы следующие показатели. Для определения уровня генерации АФК использовали хемилюминесцентный анализ (ХЛ) [3] с применением люминола и люцигенина как люминофоров и соли железа (FeSO4) в качестве активатора свечения. Хемилюминесценция в присутствии люминола в основном отражает уровень супероксидного анион-радикала О2•–, тогда как в присутствии люцигенина используется для оценки образования гидроксильного и органических радикалов [3].
Спектрофотометрически измеряли активности АОФ – СОД (К.Ф. 1.15.1.1) – по модифицированной адренохромной методике [8] и каталазы (К.Ф. 1.11.1.6) – по количеству разложенной Н2О2 [1]. Активность каталазы выражали в мкМ Н2О2, разложенной за 1 минуту, а за 1 усл. ед. активности СОД принимали количество фермента, способное затормозить реакцию автоокисления адреналина на 50 %.
Полученные данные обрабатывали с использованием пакетов программ MS Excel и Statgraphics общепринятыми методами вариационной статистики, сравнение различий между группами проводили с применением непараметрического критерия (U) Вилкоксона-Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия с р < 0,05.
Исследование проводилось с использованием Центра коллективного пользования научным оборудованием ИБ КарНЦ РАН. Работа выполнена в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. с изменениями от 1975, 1983, 1989, 2000 гг.
Результаты исследований и их обсуждение
В результате проведённого эксперимента были выявлены межвидовые различия активностей АОФ и уровня генерации АФК у контрольных животных. Гомогенаты печени песцов характеризовались по сравнению с лисицами меньшей интенсивностью люцигенин-зависимой ХЛ, что свидетельствует о более низком уровне генерации гидроксильного и органических радикалов (табл.1). При этом у песцов выявлена более высокая активность СОД, чем у лисиц. Остальные показатели (активность каталазы и уровень образования О2•–) у контрольных животных достоверно не отличались.
Несмотря на то, что исследованные нами серебристо-чёрная лисица и вуалевый песец содержатся в условиях неволи, они сохранили присущую их диким предковым видам сезонность биологических ритмов линьки, размножения и обмена веществ. Многие виды животных, в том числе дикие лисицы и песцы, обитают в динамически изменяющихся условиях окружающей среды и испытывают колебания погодных условий, доступности ресурсов и риска заражения инфекциями в течение года. Для успешного размножения и выживания их организм вынужден распределять ресурсы среди «соревнующихся» за них физиологических систем в целях максимизации приспособленности к периодически меняющимся условиям среды [6]. Это приводит к необходимости физиологического компромисса между многими системами, в частности, между иммунной и репродуктивной – у сезонных животных в осенне-зимний период наряду с активацией иммунной функции подавлена функция размножения.
Таблица 1
Влияние мелатонина на про- и антиоксидантный статус в печени животных (M±m)
|
Показатель |
Виды и группы животных |
|||
|
Лисица |
Песец |
|||
|
контроль |
опыт |
контроль |
опыт |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Активность СОД, у.е./гр ткани |
276,48±31,22 |
363,98±45,87 |
644,40±41,83 ♦ |
193,46±12,35 * |
|
Активность каталазы, мкмоль Н2О2/мин/гр ткани |
513,54±120,33 |
609,24±57,40 |
312,35±29,55 |
201,09±14,80 * |
|
Интенсивность люминол-зависимой ХЛ, тыс имп./ 40 сек/ гр ткани |
116,18±42,55 |
-9,96±66,88 |
-2378,47± 1959,76 |
2221,56±1080,74 |
|
Интенсивность люцигенин-зависимой ХЛ, тыс имп./ 40 сек/ гр ткани |
-2478,48± 1028,93 |
-2890,38± 667,52 |
-15272,40± 2235,15 ♦ |
-12735,10± 1230,58 |
Примечание: * – различия между контрольной и подопытной группами одного вида достоверны (p < 0,05); ♦ – различия между видами в контрольных группах достоверны (p < 0,05); отрицательные значения интенсивности ХЛ обозначают подавление свечения в образце по сравнению с холостой пробой
Среди эндокринных медиаторов сезонных изменений в организме фотозависимых млекопитающих важную роль играет мелатонин, обладающий ингибирующим действием на репродуктивную систему и неоднозначными, зависящими от многих факторов эффектами на иммунную функцию [4, 6, 11]. В ходе исследования нами было подтверждено действие экзогенного мелатонина, отвечающего за большинство сезонных адаптаций млекопитающих [6, 9]. За счёт имплантата мелатонина, введённого при длинном световом дне, обеспечивалось продолжительное высвобождение гормона в кровь, на что организм отреагировал как на стимул подготовки к зимним условиям существования. На подопытных животных были продемонстрированы ускоренное созревание зимнего меха и значительная прибавка в весе уже в сентябре (данные не представлены), тогда как контрольные животные достигали тех же показателей только в ноябре.
В связи с тем, что печень функционирует как центр промежуточного метаболизма, а также имеет рецепторы мелатонина, некоторые метаболические эффекты экзогенного гормона могут быть опосредованы через нее [9]. Так, на тундровой полевке (Microtus oeconomus) показано [9] стимулирующее воздействие гормона на глюконеогенез и синтез гликогена. Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что в нашем исследовании экзогенный мелатонин не вызвал статистически значимых изменений уровня генерации АФК в печени подопытных животных. Тем не менее у песцов наблюдается тенденция к увеличению концентрации О2•– (по интенсивности люминол-зависимой ХЛ) на фоне достоверного снижения активностей СОД и каталазы. Одна из важнейших функций АФК – это их участие в механизмах неспецифического иммунного ответа, в частности, оксидативного взрыва фагоцитирующих клеток [2]. Необходимый для жизнедеятельности уровень АФК поддерживается как за счет систем генерации, так и благодаря АОФ: СОД, катализирующей реакцию дисмутации О2•– с образованием Н2О2 и молекулярного кислорода, и каталазы, разлагающей Н2О2 до воды и молекулярного кислорода. Возможно, зафиксированные нами изменения показателей АОФ связаны с ролью мелатонина в усилении иммунной функции в период подготовки к зиме. Ранее на взрослых лисицах показано, что имплантат индоламина оказывает модуляторное действие на лейкопоэз, усиливая образование лимфоцитов и их функциональную активность [11].
Нами была отмечена видоспецифичность реакции системы генерации АФК и АОФ на экзогенный мелатонин у близкородственных видов – исследованные показатели у песца, приспособленного к арктическим условиям и разводимого в неволе, оказались чувствительнее по сравнению с лисицей. Сходные результаты были получены на представителях рода Peromyscus (белоногие или оленьи хомячки) [5]. Отмечено, что репродуктивная и иммунная системы особей, обитающих и/или родившихся в более высоких широтах, по сравнению с особями из более низких широт, восприимчивее к укорочению длины светового дня. Можно предположить, что и в нашем случае география места обитания диких предковых видов исследованных нами животных оказывает воздействие на чувствительность антиоксидантной системы к экзогенному мелатонину как имитатору эффекта укороченного фотопериода.
В отличие от исследований других авторов [10], показавших способности экзогенного мелатонина нейтрализовать АФК и/или повышать активности АОФ у крыс, нами был выявлен ингибирующий эффект гормона на активности СОД и каталазы у песцов наряду с отсутствием его воздействия на активность АОФ у лисиц (табл. 1). Помимо этого, уровни генерации АФК в печени животных двух видов также не претерпели статистически значимых изменений под действием экзогенного мелатонина. Различия в реакции показателей про- и антиоксидантного статуса на гормон у крыс и изученных нами хищников могут объясняться как разницей способов введения мелатонина в организм (крысам гормон инъецировали внутрибрюшинно или давали его с питьевой водой, а хищникам – подкожно имплантировали препарат), так и тем, что исследуемые животные сформировались как вид в различных условиях. Обычная белая лабораторная крыса является линией серой или канализационной крысы Rattus norvegicus, которая родом из Восточной Азии [11]. Песец – выходец из высоких широт, тогда как лисица – очень пластичный вид, в отличие от песца не обладающий узкоспециализированными адаптациями, в связи с чем характеризующийся довольно обширным ареалом распространения.
Выводы
- Имплантированный при длинном световом дне мелатонин способствовал ускоренному возникновению зимнего фенотипа животных, что подтверждает действие гормона как сезонного медиатора биологических функций.
- Реакция и чувствительность АОФ и системы генерации АФК на экзогенный мелатонин характеризуется видоспецифичностью, определяемой экологическими особенностями формирования вида.
- Воздействие мелатонина на антиоксиданты и уровень генерации О2•– в печени песцов может отражать его участие в активации иммунной системы в период подготовки к зимним условиям существования.
Рецензенты
Высоцкая Р.У., д.б.н., профессор, гл. науч. сотр. лаб. экологической биохимии Института биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск;
Мейгал А.Ю., д.м.н., профессор кафедры физиологии человека и животных, патофизиологии Петрозаводского государственного университета, г. Петрозаводск
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.