В последние годы экзополисахариды микробного происхождения привлекают внимание многих исследователей. Микробные ЭПС находят применение в ветеринарии, медицине, фармацевтической, пищевой, химической, нефтедобывающей и других отраслях, поскольку обладают широким спектром физико–химических, функционально–технологических и биологических свойств [2, 13, 14]. В связи с этим поиск новых продуцентов микробного происхождения и всестороннее их изучение представляется актуальной задачей в современной микробиологии и биотехнологии.
Целью работы явилось изучение некоторых биологических свойств ЭПС Ancylobacter abiegnus Z–0056.
Материалы и методы исследований
Объектом исследований явился экзополисахарид, впервые выделенный из культуральной жидкости диссипотрофной бактерии Ancylobacter abiegnus Z – 0056, названный нами анциланом [11]. Бактерии Ancylobacter abiegnus Z – 0056 были предоставлены сотрудниками лаборатории реликтовых микробных сообществ Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН [8]. Этот микроорганизм выделен из ультрапресных кислых дистрофных вод гниющей древесины ели Северных болот России. Диссипотрофы вносят весомый вклад в круговорот углерода в экосистеме. Они участвуют в начальной стадии разложения древесины, где концентрация легкодоступных питательных веществ невысока [8].
ЭПС выделяли по общепринятой методике [3] в нашей модификации.
Влияние ЭПС на рост бактерий и грибов изучали методами серийных разведений и диффузии в агар [10,14]. Для проведения эксперимента использовали культуры бактерий сходных местообитаний: Singulisphaera mucilaginosa Z – 0071 и Xanthobacter xylophilus Z – 0055, полученные из лаборатории реликтовых микробных сообществ Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН [8], а также тест–штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa 27533, Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209, Bacillus cereus 8035 и грибов Candida albicans 230, полученные из музея микроорганизмов кафедры микробиологии, биотехнологии и химии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова.
Токсичность ЭПС определяли по влиянию на клетки инфузорий Colpoda stenii [5] и лабораторных животных (белые мыши). Инфузории и мыши были получены из Пензенской областной ветеринарной лаборатории.
Исследования проводили на здоровых самцах белых беспородных мышей в возрасте 1–1,5 месяца со средней массой тела массой 22–25 г. Перед началом эксперимента выдерживали карантин – 21 день. Лабораторных животных содержали по общепринятым методикам [1]. Общий и биохимический анализы крови исследовали с помощью автоматического гематологического анализатора «RepcVet». Вскрытие, патоморфологическую диагностику и гистологические исследования проводили по методике Г.А. Меркулова [12]. Количество бактерий в кишечнике экспериментальных животных определяли методом серийных разведений [14]. Для культивирования бактерий использовали среды КАНАФАнМ и лактобакагар.
Результаты исследований и их обсуждение
При изучении влияния анцилана на рост бактерий было обнаружено, что добавление его в концентрации 1 г/л в питательную среду усиливает рост бактерий сходных местообитаний, таких, как Singulisphaera mucilaginosa Z–0071, а также и самого продуцента данного ЭПС–A.abiegnus Z–0056 (табл. 1).
Таблица 1
Влияние экзополисахарида A.abiegnus Z-0056 на рост микроорганизмов сходных местообитаний
|
Штамм |
D, (λ=425 нм), без добавления ЭПС |
D, (λ=425 нм), с добавлением ЭПС |
Результат |
|
S. mucilaginosa Z-0071 |
0,295 |
0,353 |
Усиление роста |
|
A. abiegnus Z-0055 |
0,551 |
0,574 |
Усиление роста |
|
X. xylophilus Z-0055 |
0,379 |
0,374 |
Не влияет на рост |
Положительное влияние в концентрациях 0,25 г/л, 0,5 г/л и 1 г/л анцилан оказывал и на рост некоторых других бактерий, в частности, Pseudomonas aeruginosa 27533. В то же время на рост таких микроорганизмов, как Xanthobacter xylophilus Z-0055, Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209, Bacillus cereus 8035, Candida albicans 230, в этих же концентрациях данный ЭПС влияния не оказывал (табл. 1, 2).
Таблица 2
Влияние экзополисахарида A. abiegnus Z-0056 на рост тест-культур микроорганизмов
|
Концентрация ЭПС |
Микроорганизмы |
Зона усиления роста вокруг лунки, мм |
|
0,25 г/л |
E. coli 01 |
- |
|
S. aureus 209 |
- |
|
|
P. aeruginosa 27533 |
3 |
|
|
B. cereus 8035 |
- |
|
|
C. albicans 230 |
- |
|
|
0,5 г/л |
E.coli 01 |
- |
|
S.aureus 209 |
- |
|
|
P.aeruginosa 27533 |
5 |
|
|
B. cereus 8035 |
- |
|
|
C. albicans 230 |
- |
|
|
1 г/л |
E. coli 01 |
- |
|
S. aureus 209 |
- |
|
|
P. aeruginosa 27533 |
10 |
|
|
B. cereus 8035 |
- |
|
|
C. albicans 230 |
- |
Примечание: «-» не наблюдали усиления роста
Добавление данного биополимера в концентрации 1 г/л в культуру инфузорий (Colpoda stenii) приводило первоначально (через 3 минуты) к их хаотичному движению (табл. 3). С пятой минуты наблюдали замедление движения отдельных клеток. Через 10 минут в поле зрения появлялись мертвые клетки. Через 30 минут наступала гибель 100 % инфузорий. Через 50 минут в поле зрения наблюдали только фрагменты клеток. В то время как в контроле (инфузории, находящиеся в физиологическом растворе без ЭПС) клетки инфузорий двигались спокойно и оставались живыми в течение всего эксперимента (3 часа). Следовательно, ЭПС A. abiegnus Z-0056 в данной концентрации токсичен для инфузорий, поскольку согласно ГОСТ [5] токсичным считается препарат, если гибель инфузорий наступает в интервале от 10 минут до 3 часов.
Таблица 3
Действие экзополисахарида A. аbiegnus Z-0056 на инфузории
|
Время, мин |
Поведение инфузорий |
|
|
с ЭПС (опыт) |
без ЭПС (контроль) |
|
|
3 |
Активное хаотичное движение |
Спокойное движение |
|
5 |
Замедление движения |
Спокойное движение |
|
10 |
Замедленное движение, некоторые клетки мертвые |
Спокойное движение |
|
30 |
100% мертвых клеток |
Спокойное движение |
|
40 |
10% мертвых клеток 90% разрушенных клеток |
Спокойное движение |
|
50 |
В поле зрения только фрагменты клеток |
Спокойное движение |
Исходя из приведенных данных, можно предположить, что исследуемый бактериальный ЭПС в природе играет роль источника питания для некоторых микроорганизмов, включая бактерии-продуценты этого биополимера. Это свойство встречается у олиготрофных бактерий, растущих в условиях дефицита питательных веществ [4]. Токсичность анцилана для инфузорий позволяет говорить о его защитной роли – ЭПС способствует защите бактерий от поедания простейшими в естественной среде обитания.
С целью оценки перспектив возможного применения анцилана были проведены испытания на лабораторных животных. Исследование токсичности ЭПС на лабораторных мышах проводили для оценки степени опасности однократного перорального введения малой и относительно высокой доз – 0,06 и 3 г на 1 кг массы тела животного соответственно. Животные были разделены на 3 группы: 1 группа – контрольная, получавшая физиологический раствор в объеме 1 мл; 2 группа мышей получала анцилан в дозе 0,06 г/кг в объеме 1 мл; 3 группа – получала анцилан в дозе 3,00 г/кг в объеме 1 мл. ЭПС и физиологический раствор вводили в организм мышей перорально через катетер натощак. Наблюдения за животными проводили в течение трех суток. В ходе эксперимента осуществляли контроль динамики массы животных. По окончании периода наблюдений всех животных контрольной и опытных групп подвергли эвтаназии с соблюдением принципов эвтаназии (применение эфирного наркоза), производили вскрытие и определение морфометрических характеристик внутренних органов. Также производили забор содержимого толстого кишечника животных и проводили посев содержимого на чашки Петри со средами для подсчета общего микробного числа бактерий (среда КАМАФАнМ), для молочнокислых бактерий (лактобакагар). Бактерии культивировали в термостате при 37 ºС в течение трех суток.
Были получены следующие результаты.
В 1-й группе (контрольной) на протяжении трех суток после введения раствора ЭПС мыши были активны, поведение соответствовало норме. Признаки интоксикации отсутствовали.
Во 2-й группе, получавшей анцилан в дозировке 0,06 г/кг, поведение животных в ходе эксперимента было угнетенным в течение двух суток, затем постепенно приходило в норму, но иногда проявлялись признаки агрессии.
В 3-й группе, получавшей ЭПС в дозировке 3 г/кг, наблюдалось поведение, сходное с поведением мышей 2-й группы. Летальных случаев не наблюдали.
В течение эксперимента не выявлено существенных различий в динамике массы опытных и контрольных животных. Это свидетельствует о том, что на данном временном отрезке пероральное поступление бактериального экзополисахарида в организм животных не отражалось на их росте.
Влияние ЭПС A. abiegnus Z-0056 на массу мышей
Было проведено визуальное изучение, а также сравнительное исследование гистологических срезов печени, почек и сердца животных контрольной и опытных групп. Согласно полученным результатам, внешний вид, размеры и состояние тканей внутренних органов мышей контрольной группы соответствовали показателям клинически здоровых животных. У мышей 3-й группы, получавшей ЭПС в дозировке 3 г/кг, наблюдали изменения в структуре тканей. Так, визуально наблюдали увеличение размера печени по сравнению с контролем. Тканевый материал печени, полученный от 3-й группы, имел более бледную и неоднородную окраску по сравнению с контролем, клетки органа более крупные. Внешний вид почек у животных опытных групп не изменен по сравнению с контролем, однако в тканевом материале, взятом от животных 3-й группы, в цитоплазме клеток видны разных размеров вакуоли, наполненные жидкостью. Внешний вид сердца не изменен по сравнению с контролем. На гистологических срезах сердца мышей 3-й группы наблюдали поверхностную дезорганизацию соединительной ткани (мукоидное набухание). Описанные изменения наблюдали и у животных 2-й группы, однако они были слабо выражены.
Таким образом, результаты визуальных наблюдений и гистологических исследований внутренних органов лабораторных мышей, получавших анцилан перорально, показывают влияние больших доз ЭПС на лимфо- и кровообращение. В малых дозах это влияние менее выражено.
В опытных группах животных наблюдали изменения некоторых показателей крови (табл. 4). Так, происходило повышение общего содержания белка в 1,1 и 1,5 раза во второй и третьей группе соответственно. Предположительно это было вызвано обезвоживанием организма [9]. Содержание билирубина возрастало во 2 группе в 1,4 раза, в 3 группе в 1,6 раза, что может быть связано с лизисом эритроцитов. Это подтверждается снижением общего количества эритроцитов, что, в свою очередь, объясняет нарушение окраски печени. Вероятно, негативное действие ЭПС на животный организм было вызвано прежде всего его способностью связывать воду.
Таблица 4
Влияние анцилана на некоторые показатели крови мышей
|
ЭПС
|
Показатели крови |
|||||
|
Билирубин, мкмоль/л |
Р |
Белок, г/л |
Р |
Количество эритроцитов, ×109/л |
Р |
|
|
Анцилан 0,06 г/кг |
6,10±0,30 |
<0,05 |
64,30±3,20 |
<0,05 |
7,57±0,30 |
<0,05 |
|
Анцилан 3,0 г/кг |
6,90±0,30 |
<0,05 |
83,60±4,10 |
<0,05 |
7,21±0,30 |
<0,05 |
|
Контроль |
4,30±0,17 |
- |
56,20±2,80 |
- |
8,00±0,40 |
- |
Таким образом, эксперименты на лабораторных животных (мыши) показали практическую безвредность анцилана при условии соблюдения дозы. По сравнению с ЭПС ксилофиланом, полученным нами ранее из культуральной жидкости диссипотрофной бактерии Xanthobacter xylophilus Z-0055 [4], анцилан не является токсичным веществом.
При исследовании влияния анцилана на микрофлору кишечника мышей было обнаружено, что при концентрации ЭПС 0,06 г/кг происходило уменьшение общего микробного числа (ОМЧ) в 3,5 раза по сравнению с контролем и увеличение числа молочнокислых бактерий в 5 раз (табл. 5). При введении анцилана в организм мышей в концентрации 3 г/кг наблюдали как увеличение ОМЧ, так и увеличение количества молочнокислых бактерий в 1,1 и 80 раз соответственно по сравнению с контролем.
Таблица 5
Влияние анцилана на микрофлору толстого кишечника мышей
|
ЭПС |
ОМЧ, ×1011 |
Р |
Количество молочнокислых бактерий, ×109 |
Р |
|
Анцилан, 0,06 г/кг |
2,00±0,09 |
<0,05 |
5,00±0,20 |
<0,05 |
|
Анцилан, 3 г/кг |
8,00±0,35 |
<0,05 |
80,00±3,25 |
<0,05 |
|
Контроль |
7,00±0,30 |
- |
1,00±0,05 |
- |
Из представленных данных видно, что пероральное введение анцилана способствует увеличению количества молочнокислых бактерий в организме животных (мышей), что наблюдается и при воздействии некоторых других бактериальных ЭПС, как было показано нами ранее [4, 6].
Согласно полученным данным, можно предположить, что бактерии A. abiegnus Z-0056 продуцируют экзополисахарид с целью защиты от поедания простейшими, а также как запасное питательное вещество. После проведения дополнительных исследований анцилан может найти свое применение в ветеринарии, например, как противопротозойное средство для животных.
Рецензенты:
Швиденко И.Г., д.м.н., профессор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского», г. Саратов;
Тихомирова Е.И., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой экологии ФГОУ ВПО «Саратовский госудаственный технический университет имени Ю.А. Гагарина», г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.