Важнейшей задачей современной фармацевтической науки является разработка новых эффективных лекарственных препаратов. Поставленная задача может быть решена двумя способами: создание новых субстанций и лекарственных форм на их основе и совершенствование известных, зарекомендовавших себя в медицинской практике лекарственных средств с целью более рационального их использования.
Обращает на себя внимание тот факт, что ранее в России был зарегистрирован лекарственный препарат на основе крови марала общетонизирующего действия («Кропанол капсулы 0,5» ФСП 42-0148-0392-00). Срок действия фармакопейной статьи в настоящий момент истек.
В последние десятилетия в Алтайском крае и Республике Алтай производится большое количество биологически активных добавок на основе крови марала. Анализ имеющейся информации указывает на то, что область применения данной продукции в виде пантогематогена в качестве общетонизирующего и адаптогенного средства очень широка: курортология, восстановительная медицина, спортивная медицина [8].
В настоящее время для получения пантогематогена применяются две технологии, которые отличаются различной степенью очистки исходного сырья (кровь используется цельная или предварительно очищенная от фибрина) и способом сушки (применяется вакуумная и распылительная). При этом отсутствуют единые подходы не только к технологии, но и к стандартизации как исходного сырья, так и готовой продукции на основе крови марала [9].
Следует отметить, что качество данной продукции контролируется согласно разработанным фирмами-производителями техническим условиям, в основном по таким товароведческим показателям, как внешний вид, цвет, вкус, запах, содержание тяжелых металлов, микробиологическая чистота, массовая доля влаги, количественное содержание гемоглобина и т.д. Биологическая активность и содержание других групп БАВ в выпускаемой продукции не определяются.
Учитывая вышеизложенное и наличие в пантогематогене высокоактивного комплекса биологически активных веществ (аминокислоты, гормоны, эпидермальный и инсулиноподобный факторы роста, витамины, минеральные вещества, пептиды, основания нуклеиновых кислот) [8], представляется целесообразным его углубленное изучение, в том числе проведение всесторонней фармакологической оценки.
Целью данного исследования является изучение острой токсичности и общетонизирующего действия препаратов крови марала различных фирм-производителей Алтайского края.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись две серии высушенной субстанции крови марала различных фирм производителей Алтайского края.
При получении обеих серий забор крови у маралов-доноров осуществлялся во время срезки пантов (май‒июнь 2013 г). Технология получения пантогематогена серии № 1 заключалась в том, что после забора кровь разливали в специальные формы и замораживали при температуре – 15 °С, после чего подвергали сушке в вакуум-шаровой мельнице В-500 (г. Бийск) при температуре 40 °С в течение 12 часов.
При получении пантогематогена серии № 2 кровь предварительно очищали от фибрина механическим методом с использованием лопастной мешалки МЛ-200 (Россия). Очищенную кровь сушили распылительным методом на сушилке РС-200 (Россия) при температуре ниже температуры коагуляции белков, в течение времени прохождения капли крови через ток воздуха.
Обе исследуемые субстанции представляли собой однородный порошок коричневого цвета с характерным запахом, практически не растворимый в воде. В связи с тем, что в последние годы многие исследователи общетонизирующее действие крови марала связывают с наличием специфического комплекса аминокислот [8], во всех сериях сырья определяли качественный и количественный состав аминокислот. Исследования проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence, (Япония) с УФ-детектированием (254 нм). Установлено, что все серии содержат одинаковый набор аминокислот. При этом их количественное содержание отдельных аминокислот в каждой серии сырья отличалось незначительно и варьировало в пределах от 0,71 и до 9,1 мг % [6, 7].
Определение острой токсичности субстанции крови марала проводили согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» на половозрелых белых мышах обоего пола (массой 20–24 г), полученных из вивария Института цитологии и генетики СО АН РФ и прошедших карантин в течение четырнадцати суток. Содержание экспериментальных животных (мышей) осуществлялось в стандартных условиях вивария на обычном рационе при свободном доступе к воде и пище, в условиях нормального температурного и светового режимов. При исследовании токсичности животные были разделены на 5 групп по 10 мышей в каждой.
Первая группа животных являлась контрольной и получала перорально с пищей хлебный шарик размером 1 см3. Указанный способ введения связан с плохой растворимостью исследуемых субстанций в воде и технической сложностью введения суспензии в крахмальном клейстере.
Вторая и третья группы животных получали серию № 1 исследуемой субстанции крови марала перорально с пищей (хлебный шарик размером 1 см3, смешанный с исследуемой пробой) однократно в течение суток в дозах 2500 и 7500 мг/кг соответственно.
Четвертая и пятая группа животных по такой же методике и в тех же дозах получали серию № 2 исследуемой субстанции крови марала.
Общая продолжительность наблюдения составляла четырнадцать суток. В первые сутки мыши находились под постоянным наблюдением. Общее состояние животных в течение опыта оценивали с учетом изменения координации движений, поведенческих реакций, дыхательной функции, нервно-мышечной возбудимости, также измеряли массу тела до получения исследуемой субстанции и после окончания наблюдения.
Определение общетонизирующей активности субстанции крови марала осуществляли согласно «Методике оценки выносливости мелких лабораторных животных для изучения адаптогенной активности некоторых лекарственных препаратов», предложенной Каркищенко В.Н. с соавт. [10].
Исследование проводили на сертифицированных аутбредных половозрелых животных обоего пола – крысах линии сток Wistar массой 130–170 г, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО АН РФ и прошедших 14-дневный карантин. Содержание экспериментальных животных осуществлялось в стандартных условиях вивария на обычном рационе, при свободном доступе к воде и пище, в условиях светового режима 12:12 ч и температуры 20–22 °С. Животные были разделены на 3 группы: 1 – контрольная; 2, 3 – экспериментальные. Первая группа крыс получала воду и хлебный шарик размером 1см3. Животные второй и третьей групп получали по той же схеме хлебные шарики, смешанные с субстанцией крови марала в дозе 300 мг/кг: соответственно серию № 1 и серию № 2.
Ванну вместимостью 80 литров наполняли водой, с температурой 27–29 °С. Для определения исходного уровня выносливости до начала эксперимента крысы всех групп запускались в воду с использованием груза, составлявшего 10 % от массы тела.
Затем, в ходе эксперимента, животные помещались в воду с вышеуказанным грузом на третьи, седьмые и десятые сутки эксперимента: контрольная группа через один час после получения хлебного шарика, вторая и третья группы – через один час после получения исследуемых образцов.
Во всех случаях при наблюдении за животными фиксировалось время их нахождения в воде до момента, когда они были уже не в состоянии удерживаться над поверхностью воды самостоятельно. Этот момент являлся точкой окончания эксперимента.
Эксперименты проводили при строгом соблюдении требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей» (Страсбург, 1986 г.) и Приказа МЗ РФ № 708 Н от 28 августа 2010 г.
Экспериментальные данные обрабатывали статистически методом вариационных рядов с использованием t-критериев Стьюдента. Результаты представлены в виде среднего значения Х и ошибки среднего m. Достоверными считали различия при достигнутом уровне значимости p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При изучении острой токсичности перорально введение измельченных пантов марала различных фирм-производителей в дозах от 2500 до 7500 мг/кг массы мышей не влияло на их общее состояние и не вызвало гибель животных. Симптомы острого отравления исследуемыми сериями измельченных пантов марала отсутствовали. В течение последующего периода наблюдения все животные были активны, подвижны, с нормальной координацией движений, стандартной реакцией на внешние раздражители, обычной частотой и глубиной дыхательных движений, нормальной консистенцией фекальных масс, частотой мочеиспускания и окраской мочи, с хорошим аппетитом и нормальным внешним видом. В течение эксперимента гибели животных не отмечено, в связи с чем установить LD50 не представилось возможным. Результаты исследования позволяют считать субстанцию крови марала указанных фирм-производителей Алтая нетоксичной в испытанном диапазоне.
Вследствие того, что максимально технически возможная доза (7500 мг/кг) не привела к гибели ни одного животного, можно сделать вывод, что LD50 > 7500 мг/кг и в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 можно отнести исследуемый препарат к 4 классу опасности (малоопасные вещества) [4].
В ходе эксперимента по изучению общетонизирующей активности субстанции крови марала различных фирм-производителей Алтая наблюдался процесс тренировки животных контрольной группы, который выражался в увеличении времени нахождения в воде на третьи сутки на 6 % (р < 0,05), седьмые ‒ на 8 % (р < 0,05) и десятые – на 12 % (р < 0,05) по сравнению с исходным уровнем.
Результаты эксперимента по изучению общетонизирующей активности исследуемых образцов субстанций крови марала представлены на диаграмме. При этом время плавания крыс контрольной группы представлено в виде горизонтальной линии и условно принято за 100 %. Возвышение диаграмм над данной линией наглядно показывает прирост времени плавания экспериментальных групп крыс по сравнению с контрольной группой (рисунок).
Динамика времени плавания крыс, получавших субстанцию крови марала 2-х серий. По горизонтальной оси – сутки эксперимента, по вертикальной оси – прирост времени плавания экспериментальных групп животных по отношению к соответствующим показателям контрольной группы, %. Примечание. * – достоверные изменения (p < 0,05) времени плавания экспериментальных групп по отношению к показателям контрольной группы
На третьи, седьмые и десятые сутки эксперимента в группе животных, получавших исследуемую серию № 1 пантогематогена, срок пребывания в воде статистически достоверно (p < 0,05) увеличился по сравнению с показателем контрольной группы, на 17, 25,6 и 29 % соответственно. Данный факт может свидетельствовать о наличии общетонизирующей активности исследуемой субстанции крови марала, и разницу в обнаруженных эффектах между подопытными и контрольными крысами (12 % (p < 0,05) на третьи, 16,6 % (p < 0,05) на седьмые и 18 % (p < 0,05) на десятые сутки) можно отнести к действию исследуемого образца.
Аналогичная тенденция наблюдалась при исследовании общетонизирующей активности групп животных, получавших кровь марала серии № 2. На третьи, седьмые и десятые сутки эксперимента срок пребывания животных в воде статистически достоверно (p < 0,05) увеличился, по сравнению с показателем контрольной группы на 14, 21 и 25,5 % соответственно. Обнаруженный эффект может свидетельствовать о наличии общетонизирующей активности субстанции крови марала, и разницу с показателями контрольной группы крыс (11 % на третьи, 14 % на седьмые и 16,5 % на десятые сутки) можно отнести к действию исследуемого образца.
Сопоставление общетонизирующей активности исследуемых серий высушенной крови марала свидетельствует о более выраженном проявлении общетонизирующей активности у образца серии № 1, полученного с применением вакуумной сушки и менее выраженной – у образца серии № 2, высушенного распылительным методом. Так, на третьи сутки эксперимента разница в обнаруженных эффектах исследуемых образцов по сравнению с контрольной группой составляла 12 и 11 %, на седьмые сутки 16,6 и 14 %, на десятые сутки 18 и 16,6 % соответственно.
Заключение
При анализе результатов изучения острой токсичности при энтеральном введении мышам пантогематогена, полученного по различным технологиям, в дозах от 2500 до 7500 мг/кг признаков острой токсичности не выявлено, летальность отсутствовала, что не позволило определить LD50. В связи с чем изучаемый препарат может быть отнесен согласно ГОСТ 12.1.007-76 к IV классу опасности (малоопасные вещества).
Данные эксперимента по изучению общетонизирующей активности пантогематогена с использованием методики, предложенной Каркищенко В.Н. с соавт., подтверждают наличие указанной активности у изучаемых субстанций, независимо от применяемых технологий, и указывают на перспективность проведения дальнейших исследований по разработке препарата общетонизирующего действия на основе крови марала.
Рецензенты:
Венгеровский А.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Томск;
Федосеева Л.М., д.фарм.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии, ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 15.05.2014.