Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время ведется активный поиск гепатопротекторных средств, повышающих устойчивость печени к воздействию экотоксикантов, усиливающих ее обезвреживающие функции путем повышения активности ферментных систем детоксикации, а также обладающих свойствами репарации мембранных структур. В России в аптечной сети широко известен препарат «Эссенциале®», который считается эталонным гепатопротектором фосфолипидной природы [6]. В последнее время все чаще внимание исследователей привлекают морские гидробионты, в частности морские водоросли, в состав которых входит достаточно высокий процент веществ липидной природы, в частности фосфолипиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) семейства n-3 [7]. Однако работ, посвященных изучению гепатопротекторной активности липидов морского происхождения из водорослей, практически нет, что обусловливает актуальность проведения исследований в плане расширения ресурсного диапазона для получения природных гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды. Наибольший интерес в этом отношении представляют собой массовые виды морских водорослей, имеющих пищевое значение, в частности Ульва продырявленная (Ulva fenestrate P. et R.: Отдел Chlorophyta – зеленые водоросли, класс Ulotrichophyceae, порядок Ulvales – ульвовые), которая в ряде районов является ценозообразующим элементом донных сообществ [2].

Целью настоящего исследования явилось изучение гепатопротекторных свойств липидной фракции, выделенной из водно-спиртового (70 %) экстракта таллома зеленой морской водоросли Ульвы продырявленной (Ulva fenestrate P. et R.) при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом.

Материалы и методы исследования

Образцы водоросли Ulva fenestrate собирали в летний период в заливе Петра Великого Японского моря, промывали морской водой и затем нагревали 2 мин в кипящей воде для инактивации ферментов. Высушенный таллом измельчали c помощью лабораторной мельницы до размеров частиц 0,5–1 мм и экстрагировали 70 % этиловым спиртом в соотношении 1:2 (по объему) сырье–экстрагент в течение 8 часов при непрерывном перемешивании. Экстракт отделяли на воронке Бюхнера под вакуумом. Жмых заливали новой порцией спирта до образования зеркала и реэкстрагировали при перемешивании в течение двух часов. Экстракты объединяли, затем упаривали спирт под вакуумом при температуре < 37 °C. Полученную маслообразную массу экстрагировали смесью хлороформ:этанол (2:1 по объему). Для разделения фаз к экстракту добавляли раствор хлористого натрия (0,73 %) в количестве 20 % от объема. После разделения фаз хлороформный слой, содержащий липиды, отделяли на делительной воронке и упаривали на роторном испарителе (Т < 37 °C) до отсутствия запаха хлороформа. Выход липидного экстракта составил 35 % от массы сухой водоросли.

Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар массой тела 130–180 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания. В качестве сравнения использовали коммерческий препарат «Эссенциале®» (полиненасыщенный фосфатидилхолин соевых бобов производства «Рон-Пуленк Рорер», Германия) [1]. Для создания острого токсического гепатита животным вводили подкожно (в дорзальную шейную складку) четыреххлористый углерод (ЧХУ) в дозе 2 мл/кг в 50 % масляном растворе (оливковое масло) ежедневно в течение 4 дней (Хабриев, 2005). С 5-го дня эксперимента одна группа животных получала в течение 7-ми дней эссенциале (в вазелиновом масле) в дозе 80 мг/кг [5], другая группа – липидный комплекс из Ульвы продырявленной в той же дозе (в вазелиновом масле). Животным контрольной группы вводили эквиобъемное количество вазелинового масла. В ходе исследования были выделены следующие группы животных по 10 крыс в каждой: 1-я – контроль; 2-я – введение ЧХУ в течение 4 дней; 3-я – введение ЧХУ с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я – введение липидной фракции из ульвы в период депривации в течение 7 дней; 5-я – введение эссенциале в период депривации в течение 7 дней. Через сутки после последнего введения препаратов крыс выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.

Липиды из ткани печени экстрагировали по методу J. Folch et al. [9]. Количество общих липидов определяли весовым методом в мг на 1 г ткани. Разделение нейтральных липидов проводили методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей гексан – серный эфир – уксусная кислота (90:10:1 по объему) [8]. Идентификацию пятен липидов проводили с помощью очищенных стандартов. Количественное содержание отдельных фракций выражали в % от суммы нейтральных липидов. В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ; BIO-LA-TEST, Чехия) и малоновый диальдегид (МДА) [3]. Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad Software Inc. USA, 2005) со встроенной процедурой проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна ‒ Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении состава липидного комплекса из экстракта ульвы продырявленной было выявлено, что более 80 % относится к категории мембраноактивных компонентов. В качестве мембраноактивной фракции принимали сумму эссенциальных фосфолипидов и нейтральных липидов, более 30 % которых составляли триацилглицерины, выполняющие роль запасных липидов в растениях. Эссенциальные фосфолипиды составляли 12 % мембраноактивной фракции липидов. Важным элементом этой композиции является высокое содержание (более 50 %) в составе фосфолипидов ПНЖК семейства n-3 – предшественниц биологически активных эйкозаноидов. Липидная фракция обладает низкой токсичностью (ЛД50 составляет более 5000 мг/кг) и безопасностью при длительных введениях в желудок и парэнтерально. В процессе эксперимента после 4-дневного введения ЧХУ масса животных снизилась на 21 % (196 ± 4,4 г против 247 ± 4,9 г в контроле; р < 0,001), а удельная масса печени животных возросла на 50 % (4,7 ± 0,23 г/100 г массы против 3,13 ± 0,18 г/100 г массы в контроле; р < 0,05). При внешнем осмотре у животных шерсть была тусклой, слипшейся в отдельные образования. Животные были слабо подвижны, плохо ели корм. В печени отмечалась сплошная зернистость жировых включений, то есть проявлялась выраженная жировая инфильтрация, характерная при интоксикации ЧХУ. Количество общих липидов в печени превышало контрольный уровень в 3,5 раза, что составляло 142,09 ± 7,22 мг/г ткани против 42,17 ± 1,97 мг/г ткани в контроле. О развитии токсического гепатита в данной экспериментальной модели свидетельствует повышение активности в крови маркерного фермента печени АлАТ в 7 раз (307,71 ± 65,30 ед./л против 43,80 ± 4,25 ед./л в контроле; р < 0,001), обусловленное выходом фермента из гепатоцитов в кровь в результате повышения проницаемости мембран. Биохимическим механизмом этого феномена является активация перекисного окисления жирных кислот мембранных фосфолипидов, что в нашем эксперименте подтверждается увеличением количества МДА в 2 раза (7,27 ± 0,15 нмоль/ мл плазмы против 3,43 ± 0,30 нмоль/мл плазмы в контроле; р < 0,001). Развитие жировой инфильтрации печени обусловлено увеличением количества триацилглицеринов (ТАГ), свободных жирных кислот (СЖК) и холестерина (ХС) при одновременном снижении эфиров жирных кислот (ЭЖК) и эфиров холестерина (ЭХС) в связи с угнетением этерифицирующей функции печени (таблица). Как видно из таблицы, после интоксикации ЧХУ в печени крыс увеличилось количество ТАГ на 11 % (р < 0,01), СЖК и ХС на 15–16 % (р < 0,01–0,001) при одновременном снижении ЭЖК на 16 % (р < 0,01) и ЭХС на 25 % (р < 0,01). Механизм данных нарушений обусловлен распадом ТАГ в жировой ткани (химический стресс), выходом жирных кислот и глицерина в кровь и их ресинтезом в ТАГ в печени. Факт низкого уровня ЭХС (снижение на 25 %, р < 0,001) свидетельствует о нарушении этерифицирующей функции печени в связи с ингибированием фермента АХАТ (ацил-КоА: холестерин-ацилтрансфераза) при интоксикации ЧХУ.

Через 7 дней после отмены ЧХУ (период депривации) в печени подопытных животных (3-я группа) большинство изученных биохимических параметров не нормализовалось, что свидетельствовало о продолжающемся токсическом стрессе и недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии.

Содержание фракций нейтральных липидов в печени крыс после поражения четыреххлористым углеродом и введения комплекса липидов из ульвы и эссенциале (M ± m)

Примечания: различия статистически значимы при *,1 – р < 0,05; **,2 – р < 0,01; ***, 3 – р < 0,001. Звездочки справа – сравнение с контрольной группой, звездочки слева – сравнение с 3-й группой (депривация), цифры справа – сравнение с 4-й группой.

Сокращения: ТАГ – триацилглицерины, СЖК – свободные жирные кислоты, ЭЖК – эфиры жирных кислот, ХС – холестерин, ЭХС – эфиры холестерина.

Масса животных в период отмены токсиканта (депривация) изменилась незначительно по сравнению со 2-й группой (ЧХУ) (увеличение на 8 %) и составила 210,83 ± 4,90 г, тогда как относительно контроля сохранялась достоверно низкой (на 15 %, р < 0,001). Удельная масса печени животных снизилась на 6 % (р < 0,05) относительно 2-й группы (ЧХУ), что составило 4,09 ± 0,11 г/100 г массы, но в то же время еще достоверно превышала контрольный уровень на 30 % (р < 0,001). В печени при вскрытии имелись зернистые включения липидов. Количество общих липидов в печени превышало контрольный уровень в 3 раза (р < 0,001), что составляло 120,46 ± 12,33 мг/г ткани. Достоверно высокими по сравнению с контролем сохранялись активность АлАТ (на 32 %, р < 0,05) и уровень МДА (на 64 %, р < 0,001), что составляло 58,03 ± 1,75 ед./л и 5,61 ± 0,19 нмоль/мл плазмы соответственно. В период депривации количество ТАГ стало еще выше, чем во 2-й группе (увеличение на 22 %, р < 0,001) (таблица). Также увеличилось количество СЖК (на 26 %, р < 0,001). В то же время величины ЭЖК и ЭХС остались на уровне таковых, зарегистрированных во 2-й группе. То есть этерифицирующая функция печени не восстановилась и процесс развития жировой инфильтрации продолжился.

Введение липидного комплекса из экстракта ульвы и эссенциале в период отмены ЧХУ показало в общем, идентичный биологический эффект, но с разной степенью выраженности. Так, в 4-й группе (ульва) масса тела крыс составляла 250,00 ± 4,13 г, тогда как в 5-й группе (эссенциале) – 230,00 ± 4,00 г, что на 7 % (p < 0,05) ниже контрольных величин. Удельная масса печени составляла 3,48 ± 0,09 г/100 г массы в 4-й группе и 2,99 ± 0,11 г/100 г массы в 5-й группе. У животных шерсть стала гладкой, пушистой, они начали хорошо есть и активно двигаться. Количество общих липидов в печени крыс 4-й группы относительно контроля полностью нормализовалось (42,87 ± 2,20 мг/г ткани), тогда как в 5-й группе эта величина была на 20 % (р < 0,05) выше (50,68 ± 2,51 мг/г ткани). Активность АлАТ при введении комплекса липидов из ульвы достоверно не отличалась от контроля (46,79 ± 2,54 ед./л), а при введении эссенциале была выше на 23 % (53,77 ± 2,51 ед./л; р < 0,05), что свидетельствует о неполном восстановлении структуры мембран гепатоцитов. Величина МДА в 4-й группе также восстановилась до контрольных величин (3,38 ± 0,10 нмоль/мл плазмы), а при введении эссенциале была на 20 % (р < 0,05) выше контроля (4,13 ± 0,11 нмоль/мл плазмы). При исследовании показателей нейтральных липидов печени после введения препаратов обращает на себя внимание выраженное снижение количества ТАГ, СЖК и ХС при одновременном увеличении ЭЖК и ЭХС по сравнению с таковыми в 3-й группе (депривация). Однако по сравнению с контролем остаются достоверные различия в печени животных 5-й группы (эссенциале). Так, количество ТАГ было повышенным на 7 % (р < 0,01), СЖК – на 11 % (р < 0,05), ХС – на 7 % (р < 0,05). При этом количество ЭЖК было снижено на 13 % (р < 0,01), а ЭХС – на 12 % (р < 0,001). Таким образом, эссенциале не полностью снял жировую инфильтрацию и не окончательно восстановил этерифицирующую функцию печени. Липидный комплекс из экстракта ульвы полностью нормализовал исследованные биохимические параметры нейтральных липидов и показал более высокую эффективность в восстановлении функции печени.

При сравнении исследованных биохимических параметров между 4-й и 5-й группами (липиды ульвы и эссенциале) отмечались выраженные достоверные различия. Так, при введении эссенциале масса животных после интоксикации ЧХУ была на 8 % (р < 0,01) меньше, а масса печени на 7 % (р < 0,01) больше, чем таковые показатели при введении липидов ульвы. Количество общих липидов печени было выше на 18 % (р < 0,05), активность АлАТ – на 15 % (р < 0,05), а количество МДА – на 22 % (р < 0,001). Среди нейтральных липидов обращает на себя внимание более высокий уровень холестерина (на 4 %, р < 0,05) и низкий – эфиров холестерина (на 9 %, р < 0,01). То есть, введение липидного комплекса из ульвы и эссенциале способствовало коррекции нарушений, вызванных интоксикацией ЧХУ, однако действие липидов из ульвы оказалось более эффективным. По-видимому, основной причиной наблюдаемых различий является то, что биологической активности полиненасыщенного фосфатидилхолина из соевых бобов, входящего в состав эссенциале, противопоставлен многокомпонентный липидный комплекс из экстракта ульвы продырявленной. Большая эффективность экстракта, по нашему мнению, обусловлена наличием в его составе практически всех известных классов фосфолипидов морского происхождения, обладающих репаративными свойствами. При этом свободные жирные кислоты с высокой степенью ненасыщенности (семейство n-3) участвуют в преобразовании лизофосфолипидов в основные структурные компоненты мембран и метаболически активные фракции фосфолипидов.

Выводы

1. Применение липидного комплекса из экстракта ульвы продырявленной при экспериментальном CCI4-гепатите сопровождалось выраженным гепатозащитным действием, которое проявлялось в восстановлении массы животных и весовых показателей печени, нормализации липидного обмена и снижении перекисного окисления липидов.

2. Механизм терапевтического действия липидного комплекса из экстракта ульвы продырявленной обусловлен:

• восстановлением структуры мембран гепатоцитов за счет встраивания фосфолипидов в липидный бислой плазматической мембраны, что тормозит выход в кровь печеночных ферментов (АлАТ);
• снятием жировой инфильтрации печени;
• активацией этерифицирующей функции печени, что способствует синтезу фосфолипидов из триацилглицеринов.

3. По исследованным показателям липидный комплекс из экстракта ульвы продырявленной показывает более высокую биологическую активность, чем таковая у препарата сравнения «Эссенциале®».

4. Ульва продырявленная является перспективным видом сырья для получения гепатопротекторных препаратов, содержащих фосфолипиды.

Рецензенты:

Богданович Л.Н., д.б.н., заведующая лабораторией инновационных медико-биологических исследований и технологий, ФГБУЗ Медицинского объединения ДВО РАН, г. Владивосток;

Палагина М.В., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией фундаментальных и прикладных проблем товароведения, Школа экономики и менеджмента Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 15.05.2014.