Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В последнее время сложилось четкое представление о том, что такие структуры, как префронтальная кора и гиппокамп, выступают в качестве регуляторов энергетического баланса, способных воспринимать и перекодировать метаболические сигналы в программы, обуславливающие адаптивные поведенческие ответы. По данным некоторых авторов нарушение гиппокампа приводит к расстройству пищевого поведения и нечувствительности в отношении сигналов голода и насыщения как у животных, так и у людей [6, 7, 13]. При этом на моделях in vitro и упрощенных поведенческих тестах (открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт, Т-лабиринт, лабиринт Морриса) было показано, что такие пептидные гормоны, как грелин, лептин и нейропептид Y, играющие важную роль в регуляции энергетического баланса, могут влиять на пластические свойства нейронов гиппокампа и, более того, на процессы обучения и памяти [15]. Причем основные заключения об участии гормонов в регуляции пищевой активности и когнитивных процессах сделаны на основе эффектов введения веществ непосредственно в мозг [8, 10, 15]. Поэтому целью настоящей работы стало исследование влияния гиппокампэктомии на уровень гормонов (грелина, лептина, нейропептида Y, тиреоидных гормонов, кортикостерона и тестостерона) в крови мышей F1 (C57BL/6×DBA/2) в зависимости от таких состояний пищевой активности, как сытость (постоянный доступ к пище), голод (доступ к пище в течение часа через сутки) и мотивационная активность (решение пищедобывательной задачи в сложной лабиринтной среде).

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 60 мышах-самцах линии F1 (C57BL/6×DBA/2), масса тела 20–22 г (питомник РАМТН), которых содержали по 10 особей в отдельных клетках. Было сформировано 6 групп: 1 – сытые животные, содержащиеся в условиях свободного доступа к пище (контроль, С-К); 2 – мыши, подвергаемые пищевой депривации в течение 24 ч (Г-К); 3 – животные, которым предлагалось сформировать мотивационное состояние для решения пищедобывательной задачи в многоальтернативном лабиринте (М-К) на фоне пищевой депривации; 4–6 группы подвергались процедуре гиппокампэктомии (НРС): НРС-С, НРС-Г и НРС-М.

Гиппокампэктомия производилась методом электролитического билатерального разрушения дорсального гиппокампа током 2 мА в течение 12 с, которое производили стереотаксически под хлоралгидратным наркозом (350 мг/кг, внутрибрюшинно) через нихромовые электроды (0,3 мм); координаты определяли по атласу мозга мыши AP (mm): –2,3, LR: – 1,75; H: 2,25 [11].

Эксперименты начинали через 2 недели после операции, длительность эксперимента 15 сут. Мышей выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира сразу после окончания обучения. Все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с регламентом декларации ЕС от 2010 г. об использовании лабораторных животных.

Мотивационное состояние формировалось в многоальтернативном лабиринте в условиях свободного выбора в процессе решения пищедобывательной задачи, алгоритм которой представлял собой 4-звенную последовательность оперантных действий. Длительность опыта составляла 10 мин. Подробное описание поведенческой модели имеется в ряде публикаций [1, 2].

При проведении обучения с помощью программы «Labirint» в режиме реального времени регистрировали следующие параметры мотивационной активности: число проб (заходов в лабиринт), двигательную активность в виде общего числа пройденных отсеков за опыт. Кроме того, в процессе обучения регистрировали 18 психо-эмоциональных реакций, которые по степени выраженности двигательной активности и психо-эмоциональному напряжению были объединены в три типа, включающих различные классы проявлений: контекстный тип – объединяющий классы: ориентировочные (нюханье, стойки), ориентационные (остановки, колебания в развилках), пассивный тип, включающий классы – груминг (умывание, чесание); двигательная заторможенность (сидение, лежание), пассивное избегание (замирание, скуление); невротико-подобный тип, включающий классы – смещенные (лизание, грызение предметов); стрессовые реакции (чихание, отряхивание); невротические проявления (тики, прыжки, чесотка – навязчивое чесание), активное избегание (карабкание вверх). Расчет осуществляли с помощью частотного анализа появления различных реакций в поведении с учетом весовых коэффициентов, которые предварительно были вычислены на основе большого массива данных по формуле

Кi = 1/Pi,

где Pi – вероятность возникновения реакции.

Используя микропланшетный иммуноферментный анализатор «ANTHOS 2010» (Австрия), определяли уровень грелина, лептина, нейропептида Y «Cusabio biotech. co., LTD» (Китай), кортикостерона «IBL» (Германия), тестостерона «DBC» (Канада), общего трийодтиронина (Т3) и общего тироксина (Т4) «Monobind Inc.» (США) в крови (иммуноферментный анализ выполнен совместно с к.м.н., с.н.с. ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН М.Е. Диатроптовым).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программного обеспечения Statistica 6.0. (StatSoft Inc., США). Проверка распределения вариационного ряда полученных данных на нормальность (Shapiro-Wilk’S test) позволила применить параметрический метод статистического анализа. Сравнение экспериментальных групп производили при помощи t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Различия считались достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Контроль. Сытый фон. Гормональный анализ сыворотки крови в контроле на сытом фоне показал, что общее содержание исследуемых гормонов соответствовало 2970,3 ± 325,2 нмоль/л. При этом в количественном отношении, по сравнению с другими гормонами, существенно преобладал лептин, промежуточное положение занимали кортикостерон и грелин, а наименьшее содержание было у нейропептида Y (табл. 1). Коэффициент лептин/грелин (л/гр) соответствовал 5,3.

Голодный фон. Двигательная активность в состоянии голода носила постоянный характер и соответствовала 292,2 ± 3,1 отсекам за 10 мин, представляя собой короткие побежки (2,03 ± 0,19 отсеков), перемежаемые психо-эмоциональными реакциями, преимущественно контекстными. Состояние голода (24 ч) сказалось на характере гормонального ответа: общий уровень содержания гормонов снизился до 2435,7 ± 119,2 нмоль/л, что составило 82 % от исходного уровня (табл. 1). Характер гормонального ответа, по сравнению с сытым фоном, оказался разнонаправленным: содержание лептина, тиреоидных гормонов и тестостерона было достоверно снижено, уровень нейропептида Y был повышен, а грелин и кортикостерон оказались нечувствительны к состоянию голода. Коэффициент л/гр снизился относительно контрольного уровня до 2,9 за счет изменения содержания лептина.

Обучение. В процессе решения задачи мыши смогли сформировать устойчивое мотивационное состояние, необходимое для многократной реализации сформированного пищедобывательного решения в пределах опыта, которое сопровождалось специфическим паттерном психо-эмоциональных проявлений, преимущественно активного типа (табл. 2). Интересно отметить, что при этом уровень двигательной активности совпадал с таковым у голодных мышей (287,6 ± 3,0 зон/отсеков за опыт). По сравнению с голодным состоянием обучение внесло определенные изменения в гормональный ответ: лептин, нейропептид Y, общий Т3 и кортикостерон сохранили уровень голодного фона, а грелин, Т4 и тестостерон отреагировали снижением уровня своего содержания. Коэффициент л/гр повысился относительно уровня голода до 3,6 за счет уменьшения содержания грелина.

Таблица 1

Особенности гормональной активности при повреждении дорсального гиппокампа у мышей F1 (C57BL/6×DBA/2)

Примечание. Показан доверительный интервал, *– р < 0,05 и ** – р < 0,01 достоверные отличия по сравнению с сытым фоном, ^ – р < 0,05 и ^^ р < 0,01 по сравнению с голодным фоном.

Таблица 2

Вклад различных психо-эмоциональных проявлений в норме и при повреждении дорсального гиппокампа (НРС) у мышей F1 (C57BL/6 x DBA/2)

Примечание. Показан доверительный интервал, * – р < 0,05 и ** – р < 0,01, достоверные отличия по сравнению с контролем в соответствии с критерием t-Student’s.

Повреждение дорсального НРС. Сытый фон. Операция серьезно повлияла на гормональную активность. В сытом состоянии общее содержание исследуемых гормонов достоверно повысилось с 2970,3 ± 325,2 в контроле до 3766,6 ± 353,2 нмоль/л у гиппокампэктомированных. При этом, как и в контроле, количественно преобладал лептин, промежуточное положение занимали кортикостерон и грелин, наименьшее содержание было у нейропептида Y. Достоверно возросло содержание грелина, лептина, нейропептида Y, тестостерона, тогда как тиреоидные гормоны оставались на уровне контроля, и только тестостерон отреагировал снижением почти в два раза. Коэффициент л/гр снизился относительно уровня интактных животных в два раза и составил 2,8.

Голодный фон. Коагуляция гиппокампа не отразилась на характере двигательной активности, поскольку уровень ее оставался таким же, как и в контроле – 296,2 ± 5,2 и 292,2 ± 3,1 зон/отсеков соответственно. Реакция на голод со стороны исследуемых гормонов была неоднородной. Содержание тестостерона и кортикостерона сохранялось на уровне, соответствующем сытому фону, уровень нейропептида Y и грелина возрастал по отношению к сытости в 1,8 раз, а секреция лептина и тиреоидных гормонов (Т3, Т4) достоверно снизилась (табл. 1). Коэффициент л/гр снизился относительно сытого фона более, чем в 3 раза и составил 0,83, что в 3,5 раз ниже, чем соответствующие показатели в голодном контроле.

Обучение. Результаты исследования показали, что, несмотря на проведенную операцию, опытные мыши справились с предложенной задачей и в течение 10 опытов смогли сформировать устойчивое мотивационное состояние. Особенность поведения гиппокампэктомированных животных заключалась в том, что характер воспроизведения сформированного навыка был неустойчив, так как минимизированный вариант решения периодически перемежался ошибочными вариантами, которые слабо сказывались на выраженности психо-эмоциональных реакций. В отличие от контроля, реакции раздражительного типа достоверно снизились, а контекстные проявления – ориентационные и ориентировочные ‒ доминировали в рисунке поведения (табл. 2).

Особенность гормонального ответа на фоне мотивационного состояния состояла в том, что резкое снижение содержания грелина и лептина сочеталось с повышением уровня нейропептида Y. В этой ситуации тиреоидные гормоны, кортикостерон и тестостерон оставались на уровне, характерном для голодного состоянии. Коэффициент л/гр увеличился относительно голода до значения 1,3, что составило 36 % от соответствующего уровня в контроле.

Гистологический анализ показал, что дорсальный гиппокамп был поврежден билатерально у 77,5 % оперированных животных (n = 40), при этом очаг разрушения охватывал область 1–1,3 мм3, начинаясь на уровне вентромедиального ядра гипоталамуса (–1,5 от брегмы) и заканчивался на уровне дорсальной части премамиллярных ядер (–2,8 от брегмы). У одного животного кроме полей СА1 и СА3 был унилатерально затронут таламус, а у двоих – мозолистое тело, в связи с чем они не учитывались при анализе данных (общий объем выборки по НРС-животным составлял n = 30).

Основная сложность соотнесения полученных нами результатов с данными литературы заключается в том, что в большинстве работ оценка влияния гормонов производится по результатам либо их внутрибрюшинного введения, либо при введении в мозг [8]. Преимущественно анализируются эффекты введения одного или нескольких гормонов без учета как возможности множественных эффектов их действия, так и возможности входить в состав различных ансамблей [14, 2].

С нашей точки зрения, особенность проведенной работы состоит в том, что анализировалась совокупность гормонов различной природы и происхождения. А также проводился учет мотивационного компонента в сопоставлении с пассивным состоянием (голод в камере содержания). Учитывая, что биохимический анализ крови проводился сразу после завершения серии с пищедобыванием, животные находились в состоянии голода, так как эффект насыщения, как известно, отставлен [11]. Соответственно, мы имели две группы животных, сходных по метаболическим характеристикам, но различающихся по фактору, позволяющему реализовывать пищевую потребность.

Обнаруженный сходный характер реакции гормонального ответа (шесть из семи: лептин, нейропептид Y, тиреоидные гормоны, кортикостерон и тестостерон) в случае обоих состояний указывает на правомочность сделанного выше допущения. И только грелин проявил чувствительность исключительно в отношении мотивационной компоненты, снижая уровень своего содержания в крови, подтверждая возможное участие грелина в мотивационной составляющей.

Главная особенность гиппокампэктомии, на наш взгляд, состояла в том, что произошло изменение базового уровня гормонов в крови (в состоянии сытости), то есть при отсутствии метаболических сдвигов. Несмотря на это, основные закономерности и тенденции, которые наблюдались в контроле, сохранялись и усиливались в отсутствии гиппокампа: особенно четко это было выражено для динамики грелина и лептина. Однако резкая реакция на активное пищевое состояние со стороны нейропептида Y и полная утрата чувствительности тестостерона к обоим пищевым состояниям позволяют заключить, что в результате гиппокампэктомии произошло изменение в структуре связей внутри мультигормонального ансамбля.

Важно отметить, что вопреки современным представлениям о ведущей роли гиппокампа в формировании адаптивного метаболического ответа как структуры памяти [4], в нашей работе гиппокампэктомия никак не затрагивала когнитивного аспекта обучения, поскольку мыши F1 (C57BL/6×DBA/2) не только обучались, но и успешно воспроизводили сложный навык. В то же время измененный характер гормонального ответа свидетельствует о том, что гиппокамп вовлечен в отслеживание гормональных сигналов и причастен к проявлению гормональной активности согласно существующим данным [3, 13].

Таким образом, исследованный гормональный ансамбль проявил высокую чувствительность к изменению состояния пищевого гомеостаза, реакция и рисунок которого зависели от уровня проявления пищевой активности. Пищевая депривация на фоне пассивного поведения сопровождалась снижением уровня лептина и тиреоидных гормонов (Т3 и Т4), в то время как содержание нейропептида Y возросло, а реакция кортикостерона не менялась. Пищедобывательная ситуация внесла специфические изменения в рисунок гормонального профиля: большинство гормонов остались на уровне, характерном для голодного состоянии, содержание грелина снизилось. В случае гиппокампэктомии общая закономерность гормонального ответа на изменение функционального состояния сохранялась и становилась более выраженной для всех исследованных гормонов, за исключением тестостерона. Сохранение исходной динамики может указывать на то, что НРС, вероятнее всего, вовлечен в систему, задающую уровень проявления гормонального ответа. Высказывается представление о том, что роль исследуемых гормонов в регуляции пищевого поведения, так же, как и характер их взаимодействия, нуждается в пересмотре на основе мультифакторной системной оценки, учитывающей возможность множественных эффектов.

Рецензенты:

Яглова Н.В., д.м.н., заведующая лабораторией развития эндокринной системы, ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, г. Москва;

Гореликов П.Л., д.м.н., заведующий лабораторией нейроморфологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 15.05.2014.