Хроническая венозная недостаточность (ХВН) является самым распространенным заболеванием вен, которое сопровождается такими симптомами, как отеки, судороги, ощущение тяжести, покалывания и скованность ног, а также на поздних стадиях пигментацией кожи и трофическими язвами [5]. Все это в значительной степени снижает качество жизни больных, приводит к снижению трудовой и социальной активности [9].
Одним из патологических проявлений ХВН является чрезмерная активация лейкоцитов, их адгезия к эндотелию сосудов и миграция в периваскулярное пространство. Активное высвобождение лейкоцитами ряда веществ приводит к повреждению эндотелия, развитию воспалительного процесса в тканях и привлечению новых лейкоцитов, что ведет к прогрессированию патологии [4]. В недавнем исследовании показана роль лейкоцитов в повреждении венозных клапанов и липодерматосклерозе [3].
Как известно, в фармакотерапии ХВН широко применяются флавоноиды и другие вещества, обладающие противовоспалительными, антиоксидантными, мембраностабилизирующими свойствами [12]. Перспективным веществом, с этой точки зрения, является дигидрокверцетин (ДГК). В недавних экспериментах было показано, что при внутривенном введении ДГК способен снижать миграцию лейкоцитов в поврежденные ткани при моделирования ишемии головного мозга [15]. Вместе с тем известно, что использование ДГК в сочетании с арабиногалактаном (АГ) повышает его фармакологическую активность [1].
Целью данной работы стала оценка влияния композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана на адгезию лейкоцитов в условиях модели хронической венозной недостаточности.
Материалы и методы исследования
В работе использовали композицию, содержащую дигидрокверцетин и арабиногалактан в соотношении 1:5 (содержание ДГК и АГ 14,9 и 80,1 % соответственно). Субстанция для исследования предоставлена ЗАО «Аметис».
Эксперименты выполнены на 17 аутбредных крысах-самцах сток Вистар массой 300–350 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария с 12/12 световым циклом и свободным доступом к воде и пище. Перед началом исследования было получено одобрение от Биоэтического комитета ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.
Хроническую венозную недостаточность у крыс моделировали путем ограничения кровотока в нижней полой вене. Для этого у животных под эфирным наркозом проводили лапаротомию, выделяли участок нижней полой вены проксимальнее правой почечной вены и подводили под него лигатуру. После чего в бедренную вену вводили гепарин в дозе 250 ед./кг и осуществляли частичную окклюзию нижней полой вены (на 2/3) при помощи иглы с диаметром сечения 0,8 мм, которую прикладывали к вене в месте лигирования. После перевязки сосуда частично восстанавливали его просвет, извлекая иглу. У ложнооперированных животных полностью повторяли оперативное вмешательство, но без этапа окклюзии сосуда.
Композицию дигидрокверцетина и арабиногалактана вводили животным опытной группы (n = 6) внутрижелудочно ежедневно в дозе 300 мг/кг (50 мг ДГК и 250 мг АГ) в виде взвеси в воде очищенной. Животные контрольной (n = 6) и ложнооперированной (n = 5) групп получали воду очищенную в эквиобъемном количестве. Последнее введение веществ осуществляли за час до измерения параметров.
Измерение давления в полой вене проводили на 14-й день эксперимента. Перед измерением давления крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, затем внутривенно вводили гепарин в дозе 250 ед./кг. Давление в нижней полой вене измеряли с помощью датчика TSD104A аппаратного комплекса «Biopac» (Biopac system, США). Доступ осуществляли через бедренную вену.
Для оценки адгезионной активности лейкоцитов пробы крови забирали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом. Фракцию лейкоцитов получали на градиенте плотности фиколл-верографина при центрифугировании. Для этого 4 мл цельной крови наслаивали на 1 мл смеси фиколла и верографина (7:16), после чего центрифугировали при 800 g в течение 25 мин. Полученное кольцо лейкоцитов собирали пипеткой и дважды отмывали в растворе Хэнкса без Са2+ и Mg2+ (0,8 % NaCl, 0,04 % KCl, 0,035 % NaHCO3, 0,006 % Na2HPO4, 0,006 % KH2PO4, 0,1 % глюкоза, pH = 7,4) при 400g в течение 15 мин. После этого осадок ресуспендировали в 5 мл раствора Хэнкса без Са2+ и Mg2+. Полученную суспензию лейкоцитов помещали в капилляр, предварительно обработанный раствором Дюльбекко (0,8 % NaCl, 0,013 % CaCl2×2H2O, 0,01 % MgCl2×6H2O, 0,02 % KCl, 0,02 % NaHPO4, 0,115 % NaH2PO4, pH = 7,4). Клетки инкубировали при 37 оС в течение 60 мин. Неадгезировавшие лейкоциты удаляли, поворачивая капилляр в вертикальное положение. После чего капилляр заполняли раствором Дюльбекко и при напряжении сдвига, создаваемом давлением 0,05 кгс/см2, удаляли со стенок капилляра адгезировавшие лейкоциты. Число клеток подсчитали в исходной суспензии, а также первом и втором смыве, используя камеру Горяева. Количество клеток в смывах выражали в процентах от числа лейкоцитов в исходной суспензии.
Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Mann ‒ Whitney U test. Результаты исследований представлены в виде M ± m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 6.0».
Результаты исследования и их обсуждение
У животных контрольной группы частичная окклюзия нижней полой вены приводила к развитию устойчивой гипертензии, что выражалось в повышении давления в 2,2 раза (p < 0,01) по сравнению с ложнооперированной группой (табл. 1). Вместе с тем в группе животных, получавших композицию ДГК и АГ, давление было достоверно ниже на 16 % по сравнению с контрольной группой.
Таблица 1
Давление в нижней полой вене у крыс на 14 день после ее частичной окклюзии
|
Группы животных |
Венозное давление, мм рт.ст. |
|
Ложнооперированные (n = 5) |
4,52 ± 0,18 |
|
Контроль (n = 6) |
9,74 ± 0,33* |
|
Дигидрокверцетин и арабиногалактан (n = 6) |
8,14 ± 0,32* + |
Примечание. * – достоверно по сравнению с ложнооперированными животными (р < 0,05); + – достоверно по сравнению с контролем (р < 0,05).
Из данных литературы известно, что используемая нами модель ХВН у животных характеризуется развитием стойкой, хотя и относительно умеренной, венозной гипертензии, которая, однако, провоцирует миграцию лейкоцитов в ткани [7]. При этом предварительная инъекция антител к белку ICAM-1 сильно ограничивает повышение уровня лейкоцитов [8].
В результате измерения адгезионной активности лейкоцитов было выявлено, что моделирование ХВН у крыс приводило к достоверному уменьшению доли неадгезировавших лейкоцитов в 2,6 раза и увеличению доли адгезировавших лейкоцитов в 1,7 раз по сравнению с ложноперированной группой (табл. 2).
В опытной группе животных применение композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана ограничивало повышение адгезионной активности лейкоцитов (табл. 2). Доли неадгезировавших и адгезировавших лейкоцитов были близки к значениям в ложнооперированной группе, причем доля последних значимо отличалась от контроля.
Таблица 2
Влияние композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана на адгезию лейкоцитов в условиях ХВН у крыс
|
Группа животных |
Неадгезировавшие лейкоциты, % |
Адгезировавшие лейкоциты, % |
|
Ложнооперированные, n = 5 |
39,0 ± 4,0 |
48,6 ± 4,7 |
|
Контроль, n = 6 |
16,5 ± 4,9* |
80,5 ± 8,3* |
|
Дигидрокверцетин и арабиногалактан, n = 6 |
31,3 ± 5,0 |
50,8 ± 7,0 + |
Примечание. * – достоверно по сравнению с ложнооперированными животными (р < 0,05); + – достоверно по сравнению с контролем (р < 0,05).
В соответствии с гипотезой лейкоцитарной активации при ХВН наблюдается усиление «прилипания» белых клеток крови к эндотелию сосудов, что объясняется снижением скорости кровотока и повышением экспрессии молекул адгезии, включая ICAM-1 и VCAM-1, эндотелиоцитами [2, 13]. Причем изменения в уровне молекул адгезии и лейкоцитарная инфильтрация тканей ног развиваются даже у здоровых людей в ответ на естественное повышение давления в венах, вызванное длительным нахождением в положении стоя [11]. Поэтому важным является не только уровень конкретного белка, но, в большей мере, баланс между воспалительными реакциями и защитными механизмами.
Как известно, флавоноиды, в том числе ДГК, способны оказывать противовоспалительное действие, ингибируя ферменты, вовлеченные в этот процесс [6, 12]. ДГК является ингибитором фосфодиэстеразы 4 типа, локализованной в различных клетках, в том числе и в лейкоцитах [15]. Благодаря своим сильным антиоксидантным свойствам ДГК способен защищать ткани от свободных радикалов, активно продуцируемых лейкоцитами, что, в свою очередь, препятствует привлечению новых клеток [2]. Прямое действие ДГК может быть обусловлено его способностью снижать экспрессию молекул адгезии ICAM-1 в кератиноцитах и Mac-1-индуцированную адгезию нейтрофилов из периферической крови человека [2, 4]. Кроме того, на модели ишемии головного мозга было обнаружено, что применение ДГК ограничивало инфильтрацию лейкоцитов и вызванное этим повреждение тканей [1].
Выводы
Таким образом, на модели ХВН, вызванной частичной окклюзией нижней полой вены крыс, было показано выраженное повышение адгезионной активности лейкоцитов. Курсовой внутрижелудочный прием композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана (50 и 250 мг/кг соответственно) восстанавливал адгезионную активность лейкоцитов до показателей ложнооперированных животных.
Рецензенты:
Плотникова Т.М., д.б.н., профессор кафедры фармакологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск;
Суслов Н.И., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией психофармакологии, ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.