Известно, что нервная и иммунная системы достаточно тесно связаны друг с другом как через гуморальные факторы, так и через непосредственные клеточные контакты [3, 7]. Активация иммунного воспаления вызывает определенные нейроэндокринные изменения в организме [4, 8]. Многие из таких изменений аналогичны тем, которые вызываются физическими или психологическими стресс-факторами [6, 5]. Это позволяет предположить, что иммунный ответ может быть как компонентом стресс-реакции, так и стресс-фактором, способным влиять как традиционные стрессоры на высвобождение кортикотропин-рилизинг гормонов гипоталамуса и на состояние других стресс-реализующих систем. Такие эффекты могут быть вызваны за счет влияния провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 , TNF-α, IFN-α на состояние нейроэндокринной системы, через регуляцию синтеза и рецепции нейромедиаторов [6]. Кроме того, есть данные о том, что стрессовые факторы и цитокины могут воздействовать синергично на биологические и поведенческие процессы, и это может иметь долгосрочные последствия через хронизацию процессов, связанных с реакцией на стресс [5]. В связи с вышеизложенным представляет определенный научный интерес исследование влияния иммунизации на состояние некоторых систем, участвующих в реализации стресс-реакции организма.
Цель исследования. Оценка состояния нейроэндокринного и цитокинового статусов организма крыс после хронического стрессирования на фоне иммунизации корпускулярным антигеном.
Материалы и методы исследования
Исследование выполнено в соответствии с Приказом МЗ и СР РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики», с ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» и было одобрено Региональным Независимым Этическим Комитетом (ГУ «Волгоградский медицинский научный центр»): протокол № 132-2012.
Эксперименты проводили на аутбредных белых крысах-самцах в возрасте 12 месяцев массой 340–380 г. (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН), разделенных на группы по 10 особей в каждой, содержавшихся в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым свето-темновым циклом, при температуре воздуха 20 ± 2 °С, влажности 60 %, свободном доступе к воде и полнорационному гранулированному корму (ГОСТ Р 50258-92).
Лабораторные животные были разделены на группы следующим образом: группа 1 (Интактная) – не подвергались стрессированию и иммунизации антигеном – эритроцитами барана (ЭБ); группа 2 (Стресс) – подвергались стрессированию и не подвергались иммунизации антигеном ЭБ; группа 3 (Стресс на фоне иммунизации) – подвергались стрессированию и иммунизации.
Иммунизацию животных осуществляли тимус-зависимым корпускулярным антигеном – эритроцитами барана однократно внутрибрюшинно в дозе 5∙108 клеток в 500 мкл физиологического раствора на 3-й день от начала стрессирования животных.
Стрессирование животных проводили путем комбинированного воздействия нескольких стрессирующих факторов в течение 6 дней (ежедневно по 30 мин) со сменой во время «сеанса» стрессорных раздражителей каждые 5 мин [1, 2].
Периферическую кровь изучали с помощью гематологического анализатора Abacus junior В12 (Австрия). Для дифференциации гранулоцитов на палочкоядерные и сегментоядерные исследовали лейкоцитарную формулу крови в гематологическом мазке.
Определение нейроэндокринового и цитокинового статуса проводили с использованием наборов фирмы «Cusabio-Rat» методом твердофазного ИФА на следующие показатели: кортикотропин-рилизинг-гормон (КТРГ), адренокортикотропный гормон (АКТГ), кортикостерон, молекула клеточной адгезии VCAM-1, IL-6.
Результаты исследования статистически обрабатывались с использованием рангового однофакторного анализа Крускала ‒ Уоллиса, критерия Ньюмена ‒ Кейлса, критерия Данна.
Результаты исследования и их обсуждение
В периферической крови животных, подвергнутых хроническому стрессу, на 8 день эксперимента наблюдался выраженный лейкоцитоз (11,99 ± 1,1∙109 кл/л против 7,72 ± 0,81∙109 кл/л у интактных животных, p < 0,05) за счет увеличения содержания лимфоцитов (9,09 ± 0,91∙109 кл/л против 5,72 ± 0,72∙109 кл/л у интактных животных, p < 0,05) и моноцитов (0,3 ± 0,08∙109 кл/л против 0,06 ± 0,03∙109 кл/л у интактных животных, p < 0,05) (табл. 1). Уровни гранулоцитарных лейкоцитов, как сегментоядерных, так и палочкоядерных в периферической крови у стрессированных животных не отличались от контрольной группы. Наибольшая реакция отмечена со стороны лимфоидного ростка. Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о наибольшей чувствительности к стрессовым воздействиям лимфоцитов среди всех субпопуляций лейкоцитов [3].
Таблица 1
Содержание разных форм лейкоцитов в периферической крови крыс (M ± m)
|
Группа 109 кл/л |
Интактные |
Стрессированные |
Стрессированные на фоне иммунизации |
|
Лейкоциты |
7,72 ± 0,81 |
11,99 ± 1,14 * |
7,95 ± 0,72 # |
|
Лимфоциты |
5,72 ± 0,72 |
9,09 ± 0,91 * |
5,20 ± 0,50 # |
|
Моноциты |
0,06 ± 0,03 |
0,30 ± 0,08 * |
0,05 ± 0,02 # |
|
Гранулоциты сегментоядерные |
1,72 ± 0,22 |
2,22 ± 0,39 |
2,37 ± 0,50 |
|
Гранулоциты палочкоядерные |
0,05 ± 0,03 |
0,07 ± 0,04 |
0,05 ± 0,02 |
|
Гранулоциты эозинофильные |
0,17 ± 0,04 |
0,31 ± 0,07 |
0,28 ± 0,08 |
Примечания:* – значимые различия (p < 0,05) от интактных животных;
# – значимые различия (p < 0,05) между группами стрессированных животных.
У стрессированных животных, подвергшихся иммунизации корпускулярным антигеном, не наблюдалось увеличения числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови в выбранные сроки наблюдения, как это было отмечено у неиммунизированных стрессированных животных. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о протективном влиянии иммунизации на стресс реакцию со стороны белого ростка периферической крови.
Для оценки состояния стресс реализующей системы гипоталамус ‒ гипофиз ‒ кора надпочечников у экспериментальных животных было исследовано содержание соответствующих гормонов. В ходе исследования выяснилось, что у крыс на 8 день эксперимента после 6 дней хронического стрессирования значимо снижен уровень кортикостерона по сравнению с интактными животными (2,8 ± 0,7 нг/мл против 5,6 ± 0,9 нг/мл у интактных животных, p < 0,05), при этом содержание в сыворотке КТРГ и АКТГ значимо не различалось (табл. 2). Это может свидетельствовать о нарушении регуляции в системе стресс реализующих систем и о возможном истощении функции коры надпочечников, так как уровень КТРГ и АКТГ незначительно увеличился.
Таблица 2
Уровни гормонов в сыворотке крови крыс (M ± m)
|
Группа Показатель |
Интактные |
Стрессированные |
Стрессированные на фоне иммунизации |
|
КТРГ, нг/мл |
0,33 ± 0,06 |
0,42 ± 0,04 |
0,56 ± 0,05* |
|
АКТГ, пг/мл |
2,1 ± 0,16 |
2,3 ± 0,16 |
2,9 ± 0,18 *# |
|
Кортикостерон, нг/мл |
5,6 ± 0,9 |
2,8 ± 0,7 * |
4,94 ± 0,8 # |
Примечания: * – значимые различия (p < 0,05) от интактных животных;
# – значимые различия (p < 0,05) между группами стрессированных животных.
Стрессирование на фоне иммунизации привело к более выраженным сдвигам в содержании исследованных гормонов в сыворотке крови животных. Так, были повышены уровни КТРГ (0,56 ± 0,05 нг/мл против 0,33 ± 0,06 нг/мл у интактных животных, p < 0,05) и АКТГ (2,9 ± 0,18 нг/мл против 2,1 ± 0,16 нг/мл у интактных животных, p < 0,05) на фоне неизмененного уровня кортикостерона относительно интактных животных. При сравнении уровней гормонов в группах стрессированных животных, выяснилось, что стрессирование на фоне иммунизации корпускулярным антигеном – эритроцитами барана ‒ приводит к значимо более высокому содержанию в сыворотке крови крыс как КТРГ, АКТГ, так и кортикостерона (0,56 ± 0,05 нг/мл против 0,42 ± 0,04 нг/мл; 2,9 ± 0,19 нг/мл против 2,3 ± 0,16 нг/мл, p < 0,05; 4,94 ± 0,8 нг/мл против 2,8 ± 0,7 нг/мл, p < 0,05 при иммунизации животных соответственно).
Эти данные показывают, что у животных, подвергнутых хроническому стрессу, наблюдается истощение механизмов стресс регуляции. При стрессировании на фоне иммунизации активность гуморальной регуляции оси гипоталамус ‒ гипофиз ‒ кора надпочечников остается на значимо более высоком уровне и признаков истощения не наблюдается.
Исследование цитокинового профиля сыворотки животных после хронического стрессирования позволило установить, что содержание молекул VCAM-1 было значимо выше (p < 0,05) в обеих группах животных, подвергнутых стрессу по отношению к интактным крысам (табл. 3).
Таблица 3
Уровни цитокинов и адгезивных молекул в сыворотке крови крыс (M ± m)
|
Группа Показатель |
Интактные |
Стрессированные |
Стрессированные на фоне иммунизации |
|
VCAM-1, нг/мл |
1,26 ± 0,21 |
2,18 ± 0,15 * |
2,32 ± 0,31 * |
|
IL-6, пг/мл |
3,01 ± 0,23 |
2,87 ± 0,16 |
2,16 ± 0,12 * # |
Примечания: * – значимые различия (p < 0,05) от интактных животных;
# – значимые различия (p < 0,05) между группами стрессированных животных.
Уровень IL-6 в сыворотке был значимо ниже у иммунизированных животных, чем у интактных и стрессированных животных (2,16 ± 0,12 пг/мл при стрессировании на фоне иммунизации против 3,01 ± 0,23 пг/мл у интактных животных и 2,87 ± 0,16 пг/мл при стрессировании, p < 0,05).
Полученные результаты позволяют заключить, что стрессирование вне зависимости от иммунизации приводит к повышению уровня циркулирующих адгезивных молекул суперсемейства иммуноглобулинов VCAM-1, которые, как известно, [3] вовлечены в регуляцию адгезии лейкоцитов к эндотелию и их миграции за пределы сосудистого русла в очаг воспаления. Следует отметить, что увеличение уровня этих молекул происходит на фоне значимого снижения уровня IL-6 у иммунизированных животных, что свидетельствует о снижении провоспалительного потенциала животных.
Заключение
В целом полученные данные позволяют заключить, что активация иммунного ответа повышает устойчивость к действию стрессорных факторов за счет снижения уровня лимфоцитоза, изменения цитокинового профиля сыворотки животных в сторону снижения провоспалительной направленности иммунных реакций.
Рецензенты:
Бородкина Л.Е., д.м.н., профессор кафедры фармакологии и биофармации ФУВ, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Волгоград;
Бугаева Л.И., д.б.н., профессор, заместитель директора НИИ фармакологии, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Волгоград.
Работа поступила в редакцию 13.05.2014