В настоящее время не вызывает сомнения, что неотъемлемым неспецифическим звеном в развитии состояния стресса, дезадаптации и возникновения патологии, в том числе патологии печени, является активация процессов свободнорадикального окисления (СРО) и нарушение функционального состояния стресс-лимитирующей системы антиоксидантной защиты (АОЗ) организма.
Функция антиоксидантных ферментов в организме включает в себя поддержание стационарной концентрации перекисей и кислородных радикалов. Глутатионредуктаза (ГР; К.Ф. 1.6.4.2), являясь частью глутатионовой антиоксидантной системы, обеспечивает синтез восстановленного глутатиона (GSH) - компонента неферментативного звена АОЗ.
Известно, что основным механизмом образования одной из самых агрессивных первичных АФК - ОН●-радикала, участвующего в инициации СРО, служит процесс, описываемый реакциями Фентона и Хабера-Вайса. В этой связи было исследовано влияние ионов Fe2+ и Fe3+, принимающих участие в данных реакциях, на активность ГР из печени крыс в норме и в условиях токсического поражения печени.
Объектом исследования служили самцы белых крыс (Rattus rattus L.). Токсическое повреждение печени моделировали пероральным введением 33% раствора CCl4 в вазелиновом масле (64мкл CCl4/100 г веса животного). Забой животных производили на 4 сутки после введения гепатотоксина. Печень крысы извлекали под наркозом после многократного перфузирования ледяным физиологическим раствором.
Активность фермента определяли спектрофотометрически на СФ-56 при 340 нм. О скорости реакции судили по падению оптической плотности в результате окисления НАДФН. Измерение активности проводили в 50мМ калий-фосфатном буфере (рН=7,4), содержащем 1мМ ЭДТА, 0,8мМ глутатион окисленный, 0,16мМ NADPH. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1мкМ продукта реакции за 1мин при 250С. Содержание белка определяли по методу Lowry.
Получение высокоочищенного ферментного препарата ГР включало несколько стадий очистки: высаливание сульфатом аммония в границах насыщения 40-75%, гель-фильтрацию на сефадексе G-25, ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрафильтрацию фракций фермента с помощью ячейки Millipore, гель-хроматографию на Тойоперл HW-65. Все этапы очистки фермента осуществляли при температуре 0-40С. Опыты проводили в 3-4 кратной биологической повторности, аналитические определения в каждой пробе-в 2-х повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики.
Исследование влияния ионов Fe2+ на активность ГР показало ингибирующее действие во всем диапазоне исследуемых концентраций. Наиболее выраженное подавление активности фермента выявлено в условиях нормы. Так, при 0,1мМ концентрации ионов Fe2+ активность ГР составила около 25% от начальной. При увеличении концентрации до 1,2мМ активность фермента составила около 3% от исходной, в то время как при токсическом гепатите при той же концентрации - 35% от начальной активности.
Зависимость активности ГР от концентрации ионов Fe3+ имеет сходный характер с влиянием Fe2+. В условиях нормы показан более значительный ингибирующий эффект ионами Fe3+, чем Fe2+. Так, при концентрации Fe3+ 0,04 мМ активность фермента составила~20%.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможных путях координации функционирования ГР с интенсивностью протекания реакции Фентона и Хабера-Вайса. Известно, что возрастание уровня ионов железа при окислительном стрессе способствует усилению генерации активных форм кислорода. Таким образом, можно предположить, что благодаря функционированию компенсаторных механизмов в патологическом состоянии ГР более устойчива к воздействию ионов железа.
Работа поддержана финансированием Министерства образования и науки РФ по программе "Развитие научного потенциала высшей школы" РНП.2.1.1.4429 и РФФИ р_офи 08-04-99018.