Апитерапия в последнее время приобретает все большую популярность. Продукты пчеловодства эффективны при лечении многих заболеваний. Если мёд, маточное молочко, цветочная пыльца широко известны, то о подморе – телах погибших пчёл – и его свойствах известно немного. Пчелиный подмор содержит комплекс биологически активных веществ, в том числе и аминокислоты, которые обусловливают разносторонний терапевтический эффект. Для оздоровительных целей пчелиный подмор может использоваться как в натуральном виде (порошок тел пчел), так и в виде продуктов более глубокой переработки, полученных путем экстракции.
Восковая моль («золотая бабочка», огнёвка) – одно из немногих живых существ, которые приспособились к обитанию в пчелином улье. Свое название она получила за уникальную способность переваривать и усваивать пчелиный воск. Издавна личинки восковой моли эффективно использовались в народной медицине при лечении большого количества заболеваний. Этот лечебный эффект можно объяснить присутствием аминокислот, в том числе девяти незаменимых, а также флавоноидов, нуклеотидов, микроэлементов и др.
Цель исследования – выбор состава, разработка технологии спиртовых извлечений из пчелиного подмора и личинок восковой моли и их анализ.
Материалы и методы исследования
В качестве материала для исследования были использованы: пчелиный подмор – неизмельчённый и измельчённый до 3 мм; личинки восковой моли – замороженные неизмельчённые.
При определении оптимальных условий получения извлечений из пчелиного подмора нами изучено влияние природы экстрагента, измельчённости сырья, способа экстрагирования на эффективность экстракции аминокислот.
В качестве экстрагента при получении извлечений из пчелиного подмора использовали воду очищенную и этанол различной концентрации (20, 40 и 60 %). Водное извлечение (отвар) готовили в соотношении 1:10 по методике ГФ ХI [2]. Спиртовые извлечения пчелиного подмора получали из неизмельчённого и измельчённого сырья в соотношениях 1:5 и 1:10 методом ремацерации. Кроме метода ремацерации нами была использована вихревая экстракция при скорости вращения 3000–4000 об/мин [5]. Полученные спиртовые извлечения отстаивали при температуре не выше 10 °С 2 суток и фильтровали.
При разработке технологии спиртового извлечения из личинок восковой моли представляло интерес исследование роли экстрагента и времени настаивания в экстракционном процессе. С этой целью использовали спирт этиловый в концентрации 25, 40 и 70 % .
Извлечения получали в защищённом от света месте при комнатной температуре в соотношении фаз 1:5 методом мацерации с периодическим перемешиванием. Длительность настаивания составляла 7, 11 и 21 сутки.
Влияние изучаемых факторов на эффективность экстракционного процесса оценивали по качественному составу и количественному содержанию аминокислот в извлечениях.
Качественный анализ свободных аминокислот проводили с помощью нингидриновой реакции и хроматографически.
При этом смешивали равные объемы исследуемого извлечения и 0,1 % свежеприготовленного раствора нингидрина и осторожно нагревали.
Хроматографический анализ проводили в тонком слое сорбента. Извлечения наносили на подготовленные хроматографические пластинки «Силуфол» и хроматографировали в системе растворителей: н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:2) параллельно со стандартными образцами аминокислот. Хроматограммы высушивали на воздухе, затем обрабатывали 0,2 % спиртовым раствором нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100–105 °С в течение нескольких минут. Аминокислоты идентифицировали по красно-фиолетовому окрашиванию пятен [1, 4].
Для подробного изучения аминокислотного состава использовали аминокислотный анализатор фирмы Shimadzu марки LC-20 Prominence. Содержание аминокислот устанавливали по площади пиков удержания идентифицированных аминокислот в мг % [1, 3, 4].
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования извлечений из пчелиного подмора, полученных с использованием различных экстрагентов, показали, что при использовании в качестве экстрагента воды извлекается 10 аминокислот; наибольшее количество аминокислот (12 наименований) извлекается 40 % этанолом (табл. 1). При использовании в качестве экстрагента 20 и 60 % этанола извлекается наименьшее количество аминокислот (9 наименований), их суммарное содержание составляет 0,89 и 1,01 мг % соответственно. Учитывая полученные результаты, для дальнейших исследований мы использовали 40 % этанол.
Таблица 1
Содержание аминокислот в извлечениях из подмора
|
№ п/п |
Содержание аминокислот, мг % |
Метод получения, экстрагент (концентрация спирта), соотношение фаз |
||||
|
Мацерация, вода очищ. 1:10, сырьё неизмельч. |
Вихревая экстракция, этанол 40 %, 1:10 |
Ремацерация, этанол 40 %, 1:10, сырьё неизмельч. |
Ремацерация, этанол 40 %, 1:10, сырьё измельчённое |
Ремацерация, этанол 40 %, 1:5, сырьё неизмельч. |
||
|
1. |
Аспарагин |
0,03 ± 0,03 |
0,39 ± 0,012 |
0,02 ± 0,01 |
0,06 ± 0,03 |
0,04 ± 0,04 |
|
2. |
Аланин |
0,07 ± 0,012 |
0,21 ± 0,03 |
0,14 ± 0,05 |
0,11 ± 0,04 |
0,15 ± 0,05 |
|
3. |
Валин |
0,24 ± 0,04 |
3,35 ± 0,05 |
0,81 ± 0,04 |
1,00 ± 0,05 |
2,72 ± 0,06 |
|
4. |
Гистидин |
0,29 ± 0,02 |
0,12 ± 0,14 |
0,07 ± 0,022 |
0,07 ± 0,02 |
0,17 ± 0,03 |
|
5. |
Глутаминовая кислота |
0,04 ± 0,015 |
– |
0,11 ± 0,014 |
0,05 ± 0,03 |
0,16 ± 0,03 |
|
6. |
Глицин |
– |
0,75 ± 0,02 |
0,26 ± 0,02 |
0,28 ± 0,012 |
0,45 ± 0,011 |
|
7. |
Изолейцин |
0,05 ± 0,05 |
0,02 ± 0,03 |
0,06 ± 0,03 |
0,02 ± 0,02 |
0,07 ± 0,012 |
|
8. |
Лейцин |
– |
– |
0,05 ± 0,011 |
0,12 ± 0,014 |
– |
|
9. |
Лизин |
– |
– |
0,30 ± 0,12 |
0,16 ± 0,02 |
0,33 ± 0,05 |
|
10. |
Пролин |
0,08 ± 0,02 |
0,18 ± 0,03 |
0,03 ± 0,013 |
0,06 ± 0,011 |
0,19 ± 0,02 |
|
11. |
Серотонин |
0,07 ± 0,011 |
0,22 ± 0,04 |
0,07 ± 0,04 |
0,09 ± 0,04 |
0,06 ± 0,02 |
|
12. |
Тирозин |
0,01 ± 0,001 |
0,05 ± 0,013 |
0,01 ± 0,04 |
– |
0,01 ± 0,001 |
|
13. |
Фенилаланин |
0,05 ± 0,02 |
0,05 ± 0,015 |
– |
0,04 ± 0,02 |
0,04 ± 0,01 |
|
Суммарное содержание |
0,92 |
5,33 |
1,91 |
2,04 |
4,40 |
|
Сравнительное изучение извлечений, полученных методом ремацерации в соотношении фаз 1:10 из неизмельчённого и измельчённого сырья показало, что в обоих вариантах извлекается одинаковый качественный состав аминокислот (по 12 наименований) и их суммарное содержание составляет соответственно 1,91 и 2,04 мг % (табл. 1). Учитывая статистически одинаковые результаты, считаем целесообразным использовать неизмельчённое сырьё.
Изучение соотношения фаз (сырьё – экстрагент) 1:5 и 1:10 выявило, что в обоих случаях извлекается по 12 наименований аминокислот, однако суммарное содержание их в первом варианте в 2,3 раза больше, чем во втором (4,40 и 1,91 мг % соответственно, табл. 1).
При использовании вихревой экстракции извлекается меньший качественный состав аминокислот (9 наименований). Однако суммарный количественный выход аминокислот выше и составляет 5,33 мг % (табл. 1).
Как показали результаты анализа спиртовых извлечений из личинок восковой моли, полученных при комнатной температуре, наибольший качественный состав аминокислот (13 наименований) извлекается при настаивании 25 % этанолом в течение 7 и 11 суток, однако суммарный выход аминокислот после 11 суток экстрагирования был в 1,5 раза больше (табл. 2).
Таблица 2
Содержание аминокислот в извлечениях из личинок восковой моли
|
№ п/п |
Содержание аминокислот, мг % |
Экстрагент (концентрация спирта), продолжительность экстракции |
||||
|
Этанол 25 %, 7 суток |
Этанол 25 %, 11 суток |
Этанол 25 %, 21 сутки |
Этанол 40 %, 11 суток |
Этанол 70 %, 11 суток |
||
|
1. |
Аспарагин |
0,15 ± 0,011 |
0,04 ± 0,02 |
0,31 ± 0,04 |
– |
0,04 ± 0,03 |
|
2. |
Аланин |
0,30 ± 0,02 |
0,48 ± 0,03 |
0,42 ± 0,02 |
0,39 ± 0,03 |
0,37 ± 0,03 |
|
3. |
Валин |
4,20 ± 0,05 |
4,93 ± 0,06 |
1,89 ± 0,021 |
0,16 ± 0,02 |
0,27 ± 0,03 |
|
4. |
Гистидин |
0,05 ± 0,01 |
0,74 ± 0,03 |
– |
0,10 ± 0,001 |
– |
|
5. |
Глутаминовая кислота |
0,02 ± 0,02 |
0,10 ± 0,01 |
0,21 ± 0,03 |
– |
– |
|
6. |
Глицин |
2,95 ± 0,06 |
3,93 ± 0,07 |
4,28 ± 0,04 |
0,55 ± 0,05 |
0,75 ± 0,03 |
|
7. |
Изолейцин |
0,09 ± 0,04 |
0,08 ± 0,02 |
0,29 ± 0,03 |
0,02 ± 0,011 |
0,05 ± 0,013 |
|
8. |
Лейцин |
0,04 ± 0,012 |
0,22 ± 0,014 |
0,06 ± 0,01 |
– |
0,01 ± 0,002 |
|
9. |
Лизин |
0,59 ± 0,02 |
1,03 ± 0,03 |
0,27 ± 0,02 |
0,02 ± 0,002 |
– |
|
10. |
Пролин |
0,35 ± 0,02 |
0,30 ± 0,03 |
0,73 ± 0,04 |
0,08 ± 0,02 |
0,18 ± 0,03 |
|
11. |
Серотонин |
0,18 ± 0,03 |
0,43 ± 0,01 |
0,24 ± 0,02 |
0,02 ± 0,011 |
– |
|
12. |
Тирозин |
0,02 ± 0,012 |
0,12 ± 0,03 |
0,06 ± 0,02 |
0,01 ± 0,03 |
|
|
13. |
Фенилаланин |
0,02 ± 0,02 |
0,11 ± 0,02 |
0,36 ± 0,03 |
0,01 ± 0,002 |
0,09 ± 0,03 |
|
Суммарное содержание |
8,97 |
12,50 |
9,13 |
1,35 |
1,76 |
|
При использовании 40 и 70 % этанола извлекается 9 аминокислот, но их суммарный выход ниже, чем при использовании 25 % этанола. Однако качественный состав аминокислот при использовании указанных концентраций спирта различен.
Заключение
Таким образом, определены технологические параметры получения извлечений из пчелиного подмора: неизмельчённое сырье; 40 % этанол; метод ремацерации или вихревой экстракции.
Для получения извлечений из личинок восковой моли оптимальным экстрагентом является 25 % этанол, метод получения – мацерация с периодическим перемешиванием в течение 11 суток.
Рецензенты:
Алексеева И.В., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической технологии, проректор по УВР, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь;
Вихарева Е.В., д.фарм.н., заведующий кафедрой аналитической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.
Работа поступила в редакцию 18.04.2014.