В 90-х годах XX столетия фармацевтической промышленностью был осуществлён прорыв в комплексной терапии атеросклероза, который ознаменовался появлением на рынке лекарственных средств статинов. Многочисленные исследования показали их высокую эффективность в снижении уровня холестерина. Однако широкое внедрение статинов на фармацевтический рынок выявило ряд побочных эффектов, среди которых наиболее серьёзной проблемой является развитие миопатии. Статиновая миопатия возникает резко и характеризуется поражением мускулатуры нижних конечностей разной степени тяжести вплоть до рабдомиолиза. В современной литературе накоплен огромный фактический и теоретический материал, посвящённый изучению патогенеза статиновой миопатии. В то же время не существует однозначного мнения о молекулярных механизмах, лежащих в основе структурно-функциональных нарушений мышечной ткани [12, 15]. В связи с вышеизложенным необходимо углубленное исследование процессов, обеспечивающих целостность сократительного аппарата, что позволит не только расширить представление о молекулярных механизмах повреждения мышечного волокна при длительном приёме статинов, но и разработать мероприятия по оптимизации обменных процессов.
Целью работы явилось выявление особенностей метаболических изменений в скелетной мускулатуре крыс после длительного приёма симвастатина (зокора).
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось на 70 беспородных крысах-самцах в возрасте 12–14 месяцев (300–350 г). Содержание животных соответствовало санитарным правилам, утверждённым МЗ СССР от 06.07.73 по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Животных кормили натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утверждёнными приказом № 755 от 12.08.77 (Приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»). Все работы проводили согласно принципам гуманного отношения к животным в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). В процессе эксперимента животные были разделены на две группы: контрольная группа – 35 интактных животных; экспериментальная группа – 35 животных, получавших в течение 3-х месяцев симвастатин (Zocor, 20 мг) по 1,5 мг один раз в сутки. По истечении срока эксперимента животных декапитировали.
Для исследования отбирали фрагменты скелетных мышц с задней лапы животного. Гомогенат мышечной ткани готовили в соотношении 1 г ткани:9 мл охлаждённого физ. раствора, центрифугировали при 3000 об/мин. В гомогенатах определяли концентрацию пировиноградной (ПВК) кислоты [8], лактата [9] и восстановленного глутатиона (GSH) [1], а также активность ферментов: супероксиддисмутазы (СОД) [2], каталазы [1], глутатионредуктазы (ГР) [9], глутатионпероксидазы (ГПО) [9]. Митохондрии выделяли дифференциальным центрифугированием после гомогенизации в солевом растворе (0,15 М KCl и 10 мМ трис-HCl). Для удаления ядерной фракции гомогенаты центрифугировали 15 мин при 640 g. Фракцию митохондрий выделяли в течение 25 мин при 20 000 g с двукратным промыванием средой выделения. Суспензию митохондрий использовали для определения активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [14] и цитохромоксидазы (ЦХО) [3].
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования представлены в таблице. В мышцах животных экспериментальной группы выявлено статистически значимое увеличение концентрации ПВК на 49,86 % (р < 0,001) и лактата на 130 % (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой. Накопление недоокисленных продуктов гликолиза свидетельствует о формировании тканевой гипоксии.
Содержание метаболитов гликолиза и активность ферментов углеводно-энергетического обмена и антиоксидантной защиты в мышцах животных экспериментальной группы
|
Группы Показатели |
Контрольная группа, n = 35 |
Экспериментальная группа, n = 35 |
|
ПВК [мкмоль/мг белка] |
0,369 ± 0,089 |
0,553 ± 0,093 (p < 0,001) |
|
Лактат [мкмоль/мг белка] |
3,957 ± 0,937 |
9,119 ± 0,930 (p < 0,001) |
|
СДГ [нмоль/мг белка] |
25,494 ± 5,60 |
30,493 ± 6,38 (p > 0,05) |
|
ЦХО [нмоль/мг белка] |
0,068 ± 0,0079 |
0,056 ± 0,0099 (p < 0,05) |
|
СОД [усл. ед./мг белка] |
15,706 ± 0,674 |
9,311 ± 0,866 (p < 0,001) |
|
Каталаза [мКат/мг белка] |
4,34 ± 0,900 |
2,163 ± 0,992 (p < 0,001) |
|
GSH [мкмоль/мг белка] |
426 ± 68,491 |
690 ± 84,933 (p < 0,05) |
|
ГПО [мкмоль/мг белка] |
176,00 ± 28,517 |
239,00 ± 41,042 (p < 0,02) |
|
ГР [мкмоль/мг белка] |
0,361 ± 0,074 |
0,722 ± 0,097 (p < 0,001) |
Примечание. р – степень достоверности относительно показателей контрольной группы.
В динамике формирования адаптивных реакций к гипоксии важнейшую регуляторную роль играет изменение активности митохондриальных ферментов. В мышцах животных экспериментальной группы выявлено повышение активности СДГ на 19,61 % (р < 0,05) на фоне снижения активности ЦХО на 17,65 % (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Динамика активности СДГ и ЦХО нередко формируется по типу своеобразных «метаболических ножниц», в которых повышение активности сукцинат-зависимого окисления сопровождается снижением акцептирования кислорода [6].
Изменение активности ферментов антиоксидантной защиты характеризуется статистически значимым снижением активности СОД на 32,07 % (р < 0,001) и каталазы на 50,16 % (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой. Динамика активности ферментов обмена глутатиона имеет противоположно направленный характер: активность ГПО была увеличена на 35,80 % (р < 0,02), ГР на 100 % (р < 0,001), концентрация GSH повышена на 61,97 % (р < 0,001) относительно контрольной группы.
Анализируя полученные данные, можно полагать, что метаболический ответ мышечной ткани животных определяется развитием тканевой гипоксии. Длительный приём статинов при физиологическом течении обменных процессов способствует формированию гипергликолиза, о чём свидетельствует статистически значимое увеличение концентрации ПВК и лактата. Накопление недоокисленных продуктов обуславливает развитие метаболического ацидоза, формирует блоки на уровне ключевых метаболитов и нарушает интеграцию путей, обеспечивающих поддержание энергетического баланса клетки. Существует мнение, что повышение уровня лактата играет ключевую роль в гипоксическом поражении клетки. Лактат, являясь L-энантимером, вступает в реакции межмолекулярной дегидратации, что приводит к образованию комплексов с фосфолипидами мембран и способствует уменьшению поступления кислорода в клетку и развитию тканевой гипоксии [10]. Повреждающее действие гипоксии реализуется путём разобщения окислительного фосфорилирования, активации прооксидантных процессов, усиления мембранной проницаемости [7, 11].
Динамика активности ферментов дыхательной цепи отражает тенденцию к нарушению работы терминальных участков передачи ē на О2, о чём свидетельствует снижение активности ЦХО. Снижение активности ЦХО способствует накоплению цитохрома с и выходу его в цитоплазму. Накапливаясь в цитоплазме, цитохром с образует комплекс с белками, инициирующими апоптоз (Apafs), что приводит к гибели клетки [13].
Одним из механизмов повреждающего действия гипоксии является активация прооксидантных процессов, приводящая к активизации ПОЛ и требующая напряжения защитных систем клетки. Согласно современным представлениям, активные формы кислорода в условиях длительной гипоксии выполняют роль сигнальных индукторов, обеспечивающих активацию генов позднего действия, ответственных за формирование адаптивных механизмов [7]. Транскрипционная активность этих генов контролируется специфическим белковым фактором – HIF-1α и обеспечивает синтез множества защитных белков (шапероны, ферменты антиоксидантной защиты, гемоксигеназа и др.). Снижение активности СОД и каталазы способствует увеличению внутриклеточного содержания супероксидного анион-радикала, вызывающего деградацию HIF-1α и снижение защитного потенциала клетки [11].
Динамика активности ферментов обмена глутатиона отражает напряжение адаптивных механизмов, направленное на сохранение структурно-функциональной целостности миоцитов, поскольку увеличение уровня GSH способствует повышению клеточной резистентности и является индикатором эффективности антиоксидантной защиты. Увеличение активности ГПО способствует сохранению целостности митохондрий, снижая выход цитохрома с и предотвращая развитие апоптоза [4].
Принимая во внимание данные литературы и результаты собственных исследований, можно полагать, что в основе изменения структурно-функционального состояния сократительного аппарата при длительном приёме статинов лежит цепь патобиохимических изменений, связанная с наличием факторов риска и приводящая к активации универсальных патофизиологических механизмов повреждения. Широкие перспективы для оптимизации обменных процессов при длительной терапии статинами открывает разработка схем нутритивной поддержки с использованием естественных метаболитов, оказывающих регуляторное влияние на сигнальные механизмы изменения активности генов, ответственных за формирование адаптивных реакций.
Рецензенты:
Колмакова Т.С., д.б.н., доцент, зав. кафедрой медицинской биологии и генетики, ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;
Горошинская И.А., д.б.н., профессор, зав. биохимической лабораторией, ФГБУ РНИОИ Минздрава России, г. Ростовна-Дону.
Работа поступила в редакцию 01.04.2014.