Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время адеметионин (S-аденозил-L-метионин) является одним из эффективных гепатопротекторов. Он участвует в реакциях трансметилирования, является биосинтетическим предшественником цистеина, таурина, глутатиона. Наряду с высокой гепатопротективной активностью адеметионин оказывает противовоспалительное, обезболивающее, антидепрессивное действие [1].

В настоящее время субстанция адеметионина в РФ не производится.

Нами поставлена цель изучить существующие способы и разработать наиболее доступный способ получения стабильной субстанции адеметионина.

Из литературных данных известно, что наиболее успешным является биосинтетический способ получения адеметионина. Сущность метода заключается в накоплении адеметионина в дрожжевых клетках в питательной среде, обогащенной метионином, лизисе дрожжевых клеток и выделении адеметионина из лизата в виде стабильной соли.

Ранее нами была получена соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой. Главным недостатком полученной соли является то, что она гигроскопична, что снижает срок хранения соли [2].

Было найдено, что добавление к двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой лактозы в соотношении 1:1 приводит к уменьшению влажности полученной соли, а следовательно, повышает срок хранения.

Нами получена субстанция соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой с добавлением лактозы в соотношении 1:1 следующим образом.

В качестве продуцента адеметионина мы использовали сухие дрожжи рода Saccharomyces сerevisiae, а в качестве питательной среды была выбрана среда Шленка [3].

Дрожжи культивировали в течение 24–30 часов при постоянном перемешивании и аэрации при температуре 30 °С. Затем проводили лизис дрожжей, содержащих адеметионин, с помощью органического растворителя и разбавленной кислоты серной. Полученный лизат отделяли от остатков дрожжей при помощи центрифугирования.

На следующей стадии осуществляли очистку лизата. Для этого адеметионин из лизата осаждали 5 % водным раствором пикролоновой кислоты. Полученный осадок отстаивали, отфильтровывали и высушивали [4, 5].

На заключительной стадии получали стабильную двойную соль адеметионина с серной толуолсульфокислотой.

К высушенному осадку пикролоната адеметионина добавляли при энергичном встряхивании растворы 0,1 моль/л серной и толуолсульфокислоты, органический растворитель – н-бутанол. Отстаивали в течение 20 минут, органический слой удаляли, водный слой промывали н-бутанолом, до удаления следов пикролоновой кислоты. Затем к водному слою добавляли обесцвечивающий уголь, затем фильтровали.

К полученному бесцветному водному раствору добавляли этанол. Образующийся осадок отделяли декантацией, высушивали при температуре 0–5 °С.

Полученная таким образом соль адеметионина представляет собой гигроскопичный порошок, очень легко растворимый в воде, практически нерастворимый в этаноле, ацетоне и других органических растворителях.

Для уменьшения гигроскопичности к полученной соли добавляли лактозу в соотношении 1:1, высушивали в эксикаторе в течение 24 часов.

Для полученной субстанции соли нами были разработаны методики качественного и количественного анализа.

Для качественного анализа двойной соли адеметионина использовали известные химические реакции, а также УФ-спектроскопию.

УФ-спектроскопию использовали для идентификации полученной соли.

Приготовление раствора испытуемого образца. Точную массу соли (0,1 г, что эквивалентно 0,02 г адеметионин-иона) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл воды, растворяли, и доводили тем же растворителем до метки. Аликвоту в количестве 5 мл переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили водой до метки. Регистрировали спектр поглощения в области от 200 до 300 нм.

Приготовление раствора стандартного образца. Из точной массы СО адеметионина сульфата п-толуолсульфоната (0,12 г, что эквивалентно 0,025 г адеметионин-иона) получали раствор по методике, приведенной выше. Раствор сравнения – вода (рис. 1).

Рис. 1. Спектр поглощения: 1 – водного РСО адеметионина п-толуолсульфоната дисульфата 0,006 %; 2 – водного раствора соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой 0,005 %

Как видно из рис. 1, в спектре поглощения раствора испытуемого образца имеется 2 максимума при длинах волн 231 нм (п-толуолсульфокислота) и 256 нм (адеметионин), которые полностью совпадают и имеют одинаковые максимумы со спектром раствора стандартного образца.

С целью идентификации компонентов соли проводили гидролиз, для этого к водному раствору полученной соли адеметионина добавляли водный раствор натрия гидроксида 1М до значения рН среды 5,0, полученный раствор нагревали в течение 30 минут, после чего охлаждали и определяли наличие остатка метионина, тио-группы, а также сульфат-иона по следующим методикам:

К 2 мл гидролизата добавляли 1 мл водного раствора натрия гидроксида 1М и 0,5 мл свежеприготовленного водного раствора нитропруссида натрия 5 %, после кипячения на водяной бане в течение 10 минут появлялось красно-фиолетовое окрашивание (тио-группа).

К 2 мл гидролизата добавляли водный раствор натрия гидрокарбоната 5 % до значения рН среды 6,5–7,0, затем добавляли 1 мл водного раствора нингидрина 10 %, кипятили в течение 5 минут при температуре около 100 °С – появлялось фиолетовое окрашивание (первичная алифатическая аминогруппа).

К 2 мл полученного гидролизата добавляли 0,5 мл водного раствора бария хлорида 5 %, образовывался белый кристаллический осадок, нерастворимый в разведенных минеральных кислотах (сульфат-ион).

Для количественного определения компонентов соли нами разработана спектрофотометрическая методика анализа.

На первом этапе исследований нами были приготовлены водные растворы СО адеметионина сульфата и СО п-толуолсульфокислоты с целью определения возможности использования непосредственного спектрофотометрического метода.

На рис. 2 представлены спектры поглощения полученных растворов.

Рис. 2. Спектры поглощения: 1 – водного раствора СО адеметионина сульфата – 0,003 %; 2 – водного раствора СО п-толуолсульфокислоты – 0,002 %

Как следует из рис. 2, полосы поглощения веществ перекрываются и делают невозможным непосредственное спектрофотометрическое определение адеметионина и п-толуолсульфокислоты. Поэтому для определения их содержания нами был использован метод Фирордта.

Результаты определения адеметионина и п-толуолсульфокислоты в модельной смеси и двойной соли приведены в табл. 1 и 2.

Выводы

1. Разработан биосинтетический способ получения субстанции адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой с добавлением лактозы в соотношении 1:1.

2. Разработаны спектрофотометрические методики подлинности субстанции двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.

3. Разработаны методики количественного определения компонентов субстанции двойной соли при помощи спектрофотометрического метода Фирордта.

Таблица 1

Результаты определения адеметионина и п-толуолсульфокислоты в модельной смеси

Таблица 2

Результаты определения компонентов в соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой

Рецензенты:

Компанцев В.А., д.фарм.н., профессор кафедры неорганической химии Пятигорского медико-фармацевтического института, филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, г. Пятигорск;

Попова О.И., д.фарм.н., профессор кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института, филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, г. Пятигорск.

Работа поступила в редакцию 26.03.2014.