Известно, что заболевания сердечно-сосудистой системы ежегодно уносят жизни миллионов человек по всему миру. В настоящее время накоплено достаточно большое количество исследований, демонстрирующих связь между нарушением функции эндотелия и сердечно-сосудистой патологией [1, 7, 22, 35]. В патогенезе и клинике сосудистых осложнений сахарного диабета, артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, атеросклерозе играет роль нарушение структурно-функциональной организации сосудистого эндотелия [10, 14, 11, 9, 35, 49]. Многочисленными исследованиями установлено, что эндотелий регулирует сосудистую проницаемость, выделяя вазоактивные вещества [13, 36], т.е. эндотелиоциты выполняют важнейшую метаболическую функцию, участвуют в регуляции сосудистого тонуса, адгезии лейкоцитов, тромбоцитов, роста сосудов, иммунобиологических свойств. Среди медиаторов, синтезируемых эндотелием, выделяют вазоконстрикторы (эндотелин І, ангиотензин II) и вазодилататоры (эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин и оксид азота (NО)) [37, 19, 36]. Дисбаланс между вазодилататорами и вазоконстрикторами с преобладанием последних приводит к так называемой эндотелиальной дисфункции [47]. Основное внимание исследователей в последние годы привлекает молекула оксида азота, являющаяся вазодилатирующим фактором. В нормально функционирующем эндотелии низкие уровни N0 постоянно высвобождаются [12, 37]. Он образуется из условно незаменимой аминокислоты L-аргинина при участии NO-синтаз (NOS). Существуют три изоформы фермента NOS, две из которых постоянно функционирующие или конститутивные ферменты: нейрональная (NOS 1 или nNOS) и эндотелиальная (NOS 3 или еNOS) NO-синтазы [26]. Эти изоформы постоянно экспрессируются в нейронах и эндотелиальных клетках (ЭК), для их активации необходимы ионы Ca2+ и кальмодулин [7]. Индуцибельная NOS (NOS 2 или iNOS) – это фермент, который экспрессируется и функционирует в ответ на действие эндотоксинов и провоспалительных цитокинов, бактериальных липополисахаридов, для ее активации практически не требуются ионы Ca2+ [7]. NO-синтазы осуществляют присоединение молекулярного кислорода к атому азота из терминальной гуанидиновой группы L-аргинина. В этой ферментной реакции участвует ряд вспомогательных факторов, включая никотиновые и флавиновые коферменты, тетрагидробиоптерин, ионы кальция, кальмодулин. NO образуется в организме при восстановлении неорганических нитратов и нитритов. Проникая из эндотелиальных клеток в гладкомышечные клетки (ГМК) сосудистой стенки, он активирует гем-содержащий фермент – растворимую гуанилатциклазу, в результате в ГМК повышается уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и, соответственно, цГМФ-зависимых протеинкиназ, снижается концентрация Ca2+ и происходит расслабление сосудов [5]. Период полураспада для оксида азота исчисляется несколькими секундами в условиях in vitro и сотыми долями секунды in vivo.
Ключевым звеном формирования эндотелиальной дисфункции (ЭД) считают снижение уровня биологически активного NO, продуцируемого сосудистым эндотелием, или снижение его биодоступности. Важнейшим звеном в цепи механизмов, ведущих к развитию дефицита NO и ЭД при многих патологиях, в том числе и при сахарном диабете (СД), является дефицит концентрации L-аргинина, которая колеблется в зависимости от возраста и диеты. В норме концентрация этой аминокислоты составляет 45–150 мкмоль/л в сыворотке крови [18]. Количество проникающего в эндотелиальные клетки аргинина зависит от активности мембранно-связанной транспортной системы, активности аргиназы и других факторов. Повышение концентрации L-аргинина в эндотелиальных клетках сопровождается усиленным образованием промежуточного продукта метаболизма аргинина – NG-гидрокси-L-аргинина, облегчающего процесс окисления аргинина NO-синтазой, а также тормозящего активность аргиназы [6,16,19]. С другой стороны, аргинин увеличивает секрецию инсулина [28, 30], повышает синтез NO, активность eNOS, вызывая эндотелийзависимую вазодилатацию. Поступление L-аргинина в ЭК подвержено негативному влиянию окисленных липопротеинов низкой плотности (оЛНП) и лизофосфатидилхолина, продукта реакции, катализируемой фосфолипазой, ассоциированной с липопротеинами низкой плотности (ЛНП) [11, 21, 33]. ЛНП тормозят высвобождение NО эндотелиальными клетками и уменьшают эндотелийзависимую вазодилатацию [2, 1].
Второй причиной низкой биодоступности NO может быть повышенный уровень в плазме крови ассиметричного диметиларгинина (АДМА), эндогенного конкурентного ингибитора еNOS, который препятствует нормальной продукции NO и может стать причиной развития дисфункции эндотелия и сосудистой инсулинорезистентности. Еще один механизм снижения продукции NO связан с повышенной продукцией активных форм кислорода (АФК) и способностью NO взаимодействовать с ними. Это касается и сниженного уровня продукции NO при СД. [4]. В некоторых случаях может иметь место и генетическая природа снижения экспрессии еNOS, о чем свидетельствуют структурные изменения (полиморфизм) еNOS-гена у больных эссенциальной артериальной гипертензией, а также снижение уровня экспрессии NO-синтазы и эндотелийзависимой вазодилатации у подростков с первичной артериальной гипертензией задолго до ее клинических проявлений [48].
Известно, что метаболизм L-аргинина в клетках протекает двумя путями [29]. L-аргинин посредством аргиназы гидролизуется в орнитин и мочевину. Другой путь превращения L-аргинина в оксид азота и цитруллин катализируется NO-синтазой. Ферменты аргиназа и NO-синтаза конкурируют между собой за общий субстрат – L-аргинин [44, 15, 17, 40, 46].
Аргиназа, фермент цикла синтеза мочевины, обладает высокой активностью, превышает таковую NO-синтазы [15]. Она представлена в виде двух изоформ: аргиназа I – печеночная форма и аргиназа II – внепеченочная форма [43, 32], локализующаяся чаще в почках, простате, тонкой кишке. Ряд исследователей подтверждает связь повышенной активности аргиназы с развитием ЭД [42, 45, 32, 39]. Причина этого заключается в том, что аргиназа ингибирует еNOS, препятствуя, таким образом, продукции оксида азота. Снижение активности аргиназы приводит к повышению выработки оксида азота, благоприятно воздействует на нормализацию сосудистой функции. Таким образом, использование ингибиторов аргиназы для увеличения синтеза NO является одним из методических подходов предотвращения развития дисфункции эндотелия. Ингибиторы аргиназы – это вещества природного происхождения, механизм действия которых заключается в блокировании фермента аргиназы, а, следовательно, в нарушении превращения L-аргинина в орнитин и мочевину [41, 42]. Вследствие этого большее количество L-аргинина расщепляется под действием NO-синтазы с образованием оксида азота. Ингибиторы аргиназы могут быть селективными и неселективными. Представителем их является L-норвалин – наименее изученный неселективный ингибитор аргиназы. По данным ряда современных авторов, повышение активности фермента цикла синтеза мочевины – аргиназы – наблюдается при многих патологиях, таких как СД, бронхиальная астма, гломерулонефриты, псориаз [34]. Рядом исследований установлено, что ингибирование этого энзима способствует увеличению продукции оксида азота и предотвращению дисфункциональных нарушений в эндотелии [35].
В единичных исследованиях продемонстрировано эндотелио- и кардиопротективное действие комбинации ингибитора аргиназы L-норвалина и донатора оксида азота L-аргинина, вводимого крысам внутрижелудочно, на фоне модели ЭД. В исследованиях ряда авторов были выбраны две модели патологии для оценки влияния на эндотелий изучаемых веществ: гипергомоцистеин-индуцированная дисфункция эндотелия и L-NАМЕ-индуцированная ЭД. L-NАМЕ – аналог эндогенного ингибитора АДМА в организме подавляет выработку N0 путем угнетения экспрессии фермента NOS-3. Дефицит оксида азота вызывает снижение эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышение вазоконстрикторных влияний, изменение системной и региональной гемодинамики, повышение артериального давления, нарушение функционального состояния миокарда, увеличение экспрессии адгезивных молекул эндотелия и другие изменения [3, 15, 38, 27]. В результате экспериментов с блокадой NО-синтазы с помощью L-NAME происходило развитие артериальной гипертензии. Кроме того, развивающийся дефицит оксида азота проявлялся увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции, снижением концентрации стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови, гипертрофией миокарда, мышечного слоя сосудистой стенки. Однако при сравнительном анализе коэффициент эндотелиальной дисфункции у животных с гипергомоцистеин-индуцированной дисфункцией эндотелия был ниже, чем у животных с L-NAМЕ-индуцированной патологией. Эти данные заставляют задуматься о более выраженном нарушении соотношения эндотелийзависимой вазодилатации и эндотелийнезависимой вазодилатации при введении L-NAME, нежели при введении метионина.
Механизм действия L-норвалина объясняется его структурным подобием с орнитином, который является одним из продуктов метаболизма цикла синтеза мочевины. Опосредованное действие L-норвалина на активность аргиназы связано с ингибированием орнитинтранскарбамоилазы, которая катализирует превращение орнитина в цитруллин в цикле синтеза мочевины [20]. В результате происходит избыточное накопление орнитина, который, в свою очередь, ингибирует аргиназу. Более того, L-норвалин повышает эндогенный синтез L-аргинина из цитруллина за счет ингибирования аргининосукцинатсинтазы, что приводит также к возрастанию продукции N0. Эндотелиопротективные эффекты L-норвалина обусловлены подавлением активности аргиназы, за счет чего происходит увеличение продукции главного вазодилатирующего медиатора эндотелия – оксида азота. Удалось выявить предотвращение повышенной адренореактивности и снижение миокардиального резерва на фоне повышения прироста сократимости миокарда при проведении гипоксической пробы. Кардиопротекция L-норвалином, по нашему мнению, может быть связана с повышением эндогенного синтеза L-аргинина за счет ингибирования активности аргининосукцинатсинтазы [25], а также накоплением L-аргинина в связи с ингибированием аргиназы. В свою очередь L-аргинин обладает рядом свойств, благотворно влияющих на деятельность сердечно-сосудистой системы: способствует деполяризации мембран клеток эндотелия и регулирует рН в этих клетках, а также рН крови, способствует нормализации реологических свойств крови, снижает формирование свободных радикалов и обеспечивает удаление их из клеток эндотелия [23, 24]. Морфологические исследования демонстрируют предотвращение под влиянием L-норвалина увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с моделированием дисфункции эндотелия введением L-NAME. А при изучении биохимических параметров сыворотки крови определили увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота при L-NAМЕ- и гомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции введением L-норвалина.
Комбинация L-норвалина и L-аргинина обладала кардиопротективным действием в обеих моделях дисфункции эндотелия. Сочетанное применение указанных веществ в более полном объеме предотвращало исчерпание миокардиального резерва при пробе на адренореактивность и нагрузку сопротивлением, а также развитие гипертрофии кардиомиоцитов. При монотерапии L-аргинином эндотелио- и кардиопротективные свойства значительно уступают сочетанному использованию L-аргинина и L-норвалина. Более ярко выраженные эффекты сочетанного применения L-аргинина и L-норвалина связаны с кумулятивными возможностями данной комбинации, с увеличением концентрации субстрата синтеза NO и ингибированием фермента аргиназы, L-норвалин увеличивает доступность эндогенных запасов L-аргинина для NО-синтазы, а также повышает активность фермента NOS-3. Введение экзогенного L-аргинина повышает концентрацию субстрата для eNOS. В исследованиях в нашей лаборатории установлено, что под влиянием L-аргинина происходит повышение уровня экспрессии eNOS., тогда как L-NAМЕ – снижает. L-аргинин проявляет антиоксидантные свойства, снижает интенсивность ПОЛ и стимулирует активность ферментов антиокислительной защиты клеток [4, 5]. Еще одним важным процессом, в определенной степени детерминирующим эффективность образования NO, является влияние окисленных ЛНП и лизофосфатидилхолина (продукта реакции, катализируемой фосфолипазой и ассоциированной с ЛНП) на транспорт L-аргинина в ЭК. В связи с этим положением с целью выяснения роли ЛНП в нарушении биодоступности оксида азота мы определяли в другом варианте исследований показатели обмена холестерина (ХС): концентрацию общего ХС, холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛВП), триацилглицеридов (ТАГ) и по формуле Фридвальда рассчитывали концентрацию ХС ЛНП. Анализ данных показал статистически достоверное повышение концентрации общего ХС (р < 0,001) в сыворотке крови у крыс с экспериментальным СД. Анализ распределения ХС в липопротеинах различной плотности показал снижение его уровня в ЛВП (р < 0,001) и значительное повышение в ЛНП (р < 0,001), т.е. в атерогенных ЛП-комплексах. Одновременно происходит повышение концентрации ТАГ (р < 0,001) [5, 6].
На фоне L-аргинина происходит повышение доступности субстрата для eNOS вследствие статистически достоверного снижения в сыворотке крови ОХС и ХС ЛПН (р < 0,001), а также повышения ХС ЛВП (р < 0,001) [5]. Следовательно, в хронической стадии аллоксанового диабета имеет место гиперхолестеринемия и гипер-β-липопротеинемия, способствующие повреждению эндотелия сосудов вследствие атерогенеза, что подтверждено нами морфологически. Более того, следует предположить, что в условиях повышенного содержания в крови реактивных форм кислорода, особенно радикала гидроксила ОН– как наиболее реакционноспособного, и вторичного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) – малонового диальдегида, происходит окислительная модификация ЛНП, включая переокисление липидов, образование конъюгированных диенов, углеродную модификацию (apо β), а также энзиматическое превращение фосфатидилхолина в лизофосфатидилхолин фосфолипазой. Все эти изменения, вызываемые оЛНП, способствуют нарушению транспорта L-аргинина из сыворотки крови в ЭК и уменьшению образования оксида азота и его биодоступности. Для выяснения взаимосвязи между концентрацией NO и липопротеиновым спектром сыворотки крови мы провели корреляционный анализ. Данные показали наличие отрицательной связи между содержанием NO и концентрацией ЛНП (r = –0,68). Эти результаты созвучны с литературными данными, свидетельствующими о торможении оЛНП высвобождения NO ЭК, что способствует уменьшению эндотелийзависимой вазодилатации [8]. Анализ данных микроциркуляции на фоне L-аргинина показал увеличение исходно сниженной средней и систолической скоростей кровотока, уменьшение повышенных упруго-эластических свойств сосудов микроциркуляторного русла – RI. Эти функциональные изменения являются следствием нарушенного метаболизма NO и интенсивности образования метаболитов ПОЛ, влияющих на проницаемость и тонус сосудов, угнетая эндотелийзависимую вазодилатацию, что подтверждается данными литературы [4, 5]. В противоположность этому на фоне L-NAME отмечалось нарушение микроциркуляторной гемодинамики, снижение средней и систолической скоростей кровотока и повышение периферического сосудистого сопротивления. Этому способствовало снижение концентрации NOx в сыворотке крови.
Таким образом, несмотря на достижения современной медико-биологической науки, проблема ранней диагностики специфических микроангиопатий на фоне развившейся дисфункции эндотелия сосудов и их патогенетически медикаментозная коррекция остается до конца не изученной. Выявление прогностических маркеров развития сосудистых осложнений при различных заболеваниях, в том числе и при сахарном диабете, выявление групп риска, применение различных методологических подходов к их профилактике и лечению остается в настоящее время актуальным.
Рецензенты:
Брин В.Б., д.м.н., профессор, зав. отделом физиологии и патологии висцеральных систем, ФГБУН «Институт биомедицинских исследований» Владикавказского научного центра РАН и Правительства РСО-Алания, г. Владикавказ;
Джиоев И.Г., д.м.н., профессор, зав. центральной научно-исследовательской лабораторией, гбоу впо «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владикавказ.
Работа поступила в редакцию 18.02.2014.