Сравнительно недавно был получен принципиально новый класс наноматериалов – наночастицы металлов, покрытые углеродной оболочкой [6, 2]. Благодаря своей структуре такие наночастицы обладают повышенной стабильностью благодаря защите металлического ядра углеродной оболочкой от факторов внешней среды, кроме того, их поверхность может быть легко модифицирована с использованием химических методов [6, 4].
Наночастицы Fe@C уже показали себя как перспективные агенты для магниторезонансной томографии [1] и целевой доставки противоопухолевых препаратов [3]. Уникален и механизм действия наночастиц в организме, связанный со способностью разрушать клетки опухали, нарушая ее однородность. Предположительно, этот факт связан со способностью наночастиц катализировать процессы оксидативного стресса вблизи околоклеточной мембраны опухоли и разрушать ее. Очевидно, это связано со способностью наночастиц металлов, имеющих на поверхности активные центры, участвовать в типичных фермент-катализируемых реакциях разложения пероксида водорода с образованием гидроксид-радикалов [5]. Оценка активности металл-углеродных, и, в частности, железоуглеродных наночастиц, в процессах генерации активных форм кислорода не проводилась.
В связи с этим целью настоящей работы являлось исследование каталитической активности наночастиц Fe@Cв процессах разложения перекиси водорода и окисления хромогенных субстратов пероксидазы, а также изучение кинетических характеристик данного процесса.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали наночастицы железа, покрытые углеродом (Fe@C) полученные методом электроимпульсного диспергирования в гексане [2]. Согласно данным, приведенным в работе [2], используемые частицы имеют в своем составе металлическое ядро, закрытое пленкой карбидов железа переменного состава, поверхность частиц покрыта пленкой гексагонального графита. Используемые частицы имеют сферическую форму со среднечисловым распределением по размерам 10-140 нм, удельная поверхность – 55,2 м2/г.
Исследование пероксидазной активности наночастиц Fe@C проводили по методике [7], основанной на протекании процесса димеризации О-фенилендиамина (OPD) с образованием хромогенного субстрата – 2,3-диаминофеназина (DАP). Оценку пероксидазной активности проводили при нормальных условиях: рН 6,0 при температуре 20 °С. Для этого методом ультразвукового диспергирования были приготовлены серии суспензий наночастиц Fe@C в 2,5 мл буферного раствора 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) при концентрации0,05 М и рН 6,0 при 20 °С. Концентрация частиц во всех опытах составляла 0,5 мг/мл. К полученной суспензии добавляли 0,4 мл 0,0022 М раствора OPD и 1,2 мл перекиси водорода с диапазоном концентраций 0,017–0,5 М. Отбор проб осуществлялся через каждые 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 минут. Каждая проба анализировалась фотометрическим методом на УФ-спектрофотометре SF-102 при длине волны 440 нм. Из данных спектрофотометрических измерений оценивалась общее содержание целевого продукта пероксидазного окисления (DАP). Концентрации реагентов рассчитывали из полученных значений поглощения согласно закону Бугера‒Ламберта‒Бэра используя молярный коэффициент абсорбции 13000 М–1·см–1 для DАP [8].
Результаты исследования и их обсуждение
Наночастицы железа, покрытые углеродом способны катализировать окисление хромогенных субстратов пероксидазы при комнатной температуре с образованием коричнево-оранжевого продукта реакции, имеющего максимум поглощения при 420–450 нм по реакции:
При протекании данной реакции под действием Fe@C на спектре поглощения реакционной массы наблюдается появление полосы поглощения в области 420 нм, свидетельствующее об образовании целевого продукта реакции – 2,3-диаминофеназина (DАP), а также наблюдается снижение поглощения при 290 нм, ассоциируемого с OPD. При проведении реакции в отсутствие катализатора в реакционной массе не наблюдается образование продукта димеризации.
Основные кинетические параметры реакции определяли по известным методикам [5, 7, 9] посвященные изучению кинетики известных качественных реакций с субстратами пероксидазы и нахождению основных параметров каталитической активности наночастиц при комнатной температуре.
Расчет скорости реакции при различных концентрациях вносимой перекиси водорода определяли по тангенсу угла наклона линейного участка кривой зависимости изменения концентрации DАP от времени реакции. Кривая, представленная на рис. 1, подтверждает, что реакция окисления, катализируемая наночастицами Fe@C, соответствует кинетическому уравнению Михаэлиса-Ментен для ферментативной кинетики [5]. Трансформация полученной кривой, согласно методу Лайнуивера–Берка [7], позволяет определить основные каталитические параметры реакции.
Рис. 1. Зависимость скорости реакции катализируемой наночастицами Fe@C от концентрации перекиси водорода
Рассчитанные кинетические параметры сравнивали с известными литературными данными для пероксидазы хрена (HRP). Значение константы Михаэлиса для наночастиц по отношению к Н2О2 составляет 37,1 мМ, что почти в 10 раз выше, чем для HRP. Этот факт свидетельствует, что для достижения максимальной активности наночастицы требуют большую концентрацию Н2О2чем для фермент HRP. При этом скорость протекания реакции составляет 1,11∙10–5 Mc–1 и на несколько порядков превышает данный показатель для фермента. Данный факт связан с увеличением активных центров разложения перекиси на поверхности наночастиц по сравнению с ферментом, содержащим только один активный центр.
Исследование кинетики проводили при нормальных условиях, однако на скорость протекания процесса оказывают влияние внешние факторы, такие как рН, температура, концентрация вносимой Н2О2 и концентрация катализатора. Пероксидазную активность наночастиц исследовали, изменяя рН в пределах 1,61–12 и температуру в пределах 25–40 °С и сравнивали полученные данные с оптимальными условиями для работы фермента. Оптимальные значения рН и температуры лежат в пределах 4,0 и 30 °С и схожи с оптимальными значениями для фермента, как представлено на рис. 2, 3.
Исследовано влияние концентрации наночастиц на скорость протекания реакции окисления OPD, как показано на рис. 4.
Рис. 2. Кривая зависимости относительной активности наночастиц от рН раствора
Рис. 3. Кривая зависимости активности наночастиц от температуры
Рис. 4. Кривая зависимости поглощения от концентрации наночастиц
Полученная линейная зависимость поглощения при 420 нм от концентрации наночастиц с коэффициентом корреляции 0,987 свидетельствует о возможности применения данных свойств наночастиц в аналитических целях. Предельная концентрация наночастиц в этом составляет 8 мг/мл. При увеличении концентрации свыше 8 мг/мл наблюдается резкое снижение скорости реакции вследствие агломерации наночастиц в растворе.
Заключение
Наночастицы железа, покрытые углеродной оболочкой, проявляют ярко выраженные пероксидазные свойства, вследствие чего являются эффективными катализаторами для генерации гидроксид-радикалов в окислительных процессах. Катализ с использованием Fe@С протекает по типичному механизму ферментативной кинетики, и предложенные системы могут быть использованы в различных процессах селективного окисления органических соединений.
Работа выполнена при поддержке финансовой поддержки РФФИ, грант № 13-03-98009.
Рецензенты:
Юсубов М.С. Оглы, д.х.н., профессор, зав. кафедрой технологии органических веществ и полимерных материалов Института природных ресурсов Национального исследовательского Томского политехнического университета, г. Томск;
Романенко С.В., д.х.н., профессор, зав. кафедрой экологии и безопасности жизнедеятельности Института неразрушающего контроля, Национального исследовательского Томского политехнического университета, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 17.01.2014.