Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

THE INFLUENCE OF PROPRANOLOL, AMIODARONE AND VERAPAMIL ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE CNS RECEPTORS, CONJUGATED WITH ION CHANNELS

Turovaya A.Y. 2 Uvarov A.V. 2 Galenko-Yaroshevsky P.A. 2 Dukhanin A.S. 1 Kade A.K. 2
1 SBEI HPE «National Research Medical Universit» named after N.I. Pirogov of the Ministry of Health of the Russian Federation
2 SBEI HPE «Kuban State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation
The studying of the influence of II, III and IV classes antiarrhythmics (propranolol, amiodarone and verapamil) on the functional activity of the CNS membrane receptors, conjugated with ion channels showed, that verapamil limited Ca2+ level increasing in synaptosomes of medulla oblongata, s ventrolateral section, induced by the 5-HT3 type serotonin and NMDA type glutamate receptors activation. Amiodarone reduces the Ca2+ and Na+ levels increase in synaptosomes during NMDA type glutamate receptors stimulation. Propranolol does not affect the studied types of receptors. The processes described might be revealed in vivo mostly as cutting central antiarrhythmic effect, which is caused by Ca2+ and Na+ ion current blockade. The experiments have proved this effect to be the most typical for verapamil.
propranolol
amiodarone
verapamil
central antiarrhythmic effects
5-HT3 serotonin receptors
GABAA receptors
NMDA glutamate receptors
P2X purin receptors
1. Turovaya A.Yu., Kade A.Kh., Galenko-Yaroshevsky P.A. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2001, no. SUPPL. 2, pp. 89–93.
2. Kade A.Kh., Turovaya A.Yu., Galenko-Yaroshevsky P.A., Uvarov A.V., Gubareva E.A., Romanova E.I. Fundamental research 2010, no. 1, pp. 51–56.
3. Turovaya A.Yu., Galenko-Yaroshevsky P.A., Kade A.Kh., Uvarov A.V., Kiguradze M.I., Khvitiya N.G., Tatulashvili D.R. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2005, vol. 139, no. 6, pp. 665–667.
4. Turovaya A.Yu., Kiguradze M.I., Galenko-Yaroshevsky P.A., Kade A.Kh., Uvarov A.V., Tatulashvili D.R., Sukoyan G.V. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2005, vol. 139, no. 5, pp. 569–571.
5. Galenko-Yaroshevsky A.P., Turovaya A.Yu., Gorodzhaya G.G. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2002, no. SUPPL. 2, pp. 58–62.
6. Pankratov Y, Lalo U, Krishtal OA, Verkhratsky A. P2X receptors and synaptic plasticity. Neuroscience. 2009 Jan 12;158(1):137–48.
7. Moult P.R. Neuronal glutamate and GABAA receptor function in health and disease. Biochem Soc Trans. 2009 Dec;37(Pt 6):1317–22.
8. Kalia L.V., Kalia S.K., Salter M.W. NMDA receptors in clinical neurology: excitatory times ahead. Lancet Neurol. 2008 Aug;7(8):742–55.
9. Dunkley P.R., Jarvie P.E., Robinson P.J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 2008;3(11):1718–28.
10. Smith T.L. Regulation of intrasynaptosomal free calcium concentrations: studies with the fluorescent indicator, fluo-3. Neurochem Int. 1990;16(1):89–94.
11. Galvan E., Sitges M. Characterization of the participation of sodium channels on the rise in Na + induced by 4-aminopyridine (4-AP) in synaptosomes. Neurochem Res. 2004 Feb;29(2):347–55.
12. Minta A., Kao J.P.Y., Tsien R.Y. J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. pp. 8171–8178.
13. Hayashi H., Satoh H., Noda N., Terada H. et al. Am.J.Physiol. 1994, Vol. 266, N 2 Pt 1, pp. 416–422.
14. Engblom A.C., Akerman K.E. Determination of the intracellular free chloride concentration in rat brain synaptoneurosomes using a chloride-sensitive fluorescent indicator. Biochim Biophys Acta. 1993 Dec 12;1153(2):262–6.
15. Griffin H.D., Hawthorne J.N. Calcium-activated hydrolysis of phosphatidyl-myo-inositol 4-phosphate and phosphatidyl-myo-inositol 4,5-bisphosphate in guinea-pig synaptosomes. Biochem J. 1978 Nov 15;176(2):541–52.

Проведенные ранее исследования центральных симпатоингибирующих свойств у антиаритмиков II, III и IV классов – пропранолола, амиодарона и верапамила ‒ выявили способность данных препаратов оказывать различной степени выраженности превентивное либо купирующее действие при аритмиях, индуцированных химической и электростимуляцией симпатоактивирующего центра продолговатого мозга кошек [1,2], а также подавлять выработку возбуждающих и увеличивать содержание тормозных нейроаминокислот в этой области мозга [3, 4, 5].

Учитывая полученные данные, представляло интерес исследовать влияние вышеназванных антиаритмиков на основные рецепторные системы, принимающие участие в центральных механизмах регуляции сердечного ритма. К ним относятся два различных семейства рецепторных систем, отличающихся по механизмам передачи внеклеточного сигнала с плазматической мембраны нейронов и формирования клеточного ответа. Одно из семейств мембранных рецепторов нейромедиаторов/нейромодуляторов ЦНС объединяет рецепторы, встроенные в плазматические мембраны нейронов, которые одновременно являются ионными каналами. Активацию таких рецепторов можно оценить по изменению содержания ионов кальция, натрия, хлора в синаптосомальных везикулах, образованных плазматическими мембранами. К ним относятся 5-HT3-тип рецепторов серотонина и P2X-пуриновые рецепторы, ГАМКA-тип рецепторов ГАМК- и NMDA-тип рецепторов глутамата.

Активность 5-HT3-типа рецепторов серотонина и P2X-пуриновых рецепторов опосредована открытием кальциевого канала и последующим повышением внутриклеточного/синаптосомального уровня свободных ионов кальция ([Са2 + ]вн) [6]. Активность ГАМКA типа рецепторов ГАМК определяется током ионов хлора через ионофор, входящий в состав ГАМК-бензодиазепинового комплекса [7]. Активация NMDA-типа рецепторов глутамата сопровождается открытием катионового канала и поступлением ионов кальция и натрия из внеклеточного пространства в синаптосомы [8].

Другое семейство мембранных рецепторов нейромедиаторов/нейромодуляторов ЦНС представлено рецепторами, локализованными в плазматических мембранах нейронов, работа которых сопряжена с активацией G-белков.

Целью исследования явилось сравнительное изучение влияния антиаритмиков различных классов – пропранолола (II), амиодарона (III) и верапамила (IV) ‒ на функциональную активность рецепторов, сопряженных с ионными каналами (5-HT3-тип рецепторов серотонина, ГАМКA-тип рецепторов ГАМК, NMDA-тип рецепторов глутамата и P2X-пуриновые рецепторы).

Материалы и методы исследования

Везикулы плазматических мембран – синаптосомы – из вентролатеральных отделов продолговатого мозга (ВЛПМ) кошек получали методом дифференциального центрифугирования в градиенте перколла [9]. Для оценки изменений внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция и натрия использовали специфические флуоресцентные индикаторы Fluo-3 и SBFI. Процедуры нагружения синаптосом флуоресцентными зондами, расчет концентрации ионов в везикулах проводили по методикам, описанным в работах [10, 11]. Конечная концентрация зондов во внутривезикулярной среде составляла 5–7 мкМ. Концентрацию везикулярного ионизированного кальция ([Са2+]вн) рассчитывали по формуле [12]:

[Са2+ ]вн = Кd×(Fmax – F530)/(F530 – Fmin),

где F530 - интенсивность флуоресценции образца при 530 нм; Fmax – флуоресценция в условиях насыщения зонда кальцием, определяемая после внесения 30 мкМ дигитонина и 1 мМ СaCl2; Fmin - интенсивность флуоресценции при нулевой (в присутствии 5 мМ ЭДТА и 5 мкМ А23187) концентрации кальция; Кd - равновесная константа диссоциации комплекса Fluo-Ca, равная 0,42 мкМ. Перед измерением включения Са2 + пробы преинкубировали при 37° в течение 30 мин – времени, достаточного для достижения равновесия в системе «среда-везикулы». Для вычисления количества Са2+, накопленного в везикулах, в предварительных экспериментах был определен внутривезикулярный объем (W), который составил 92 мкл/мг белка.

Для перерасчета интенсивности флуоресценции зонда SBFI в [Na + ]вн выполняли процедуру калибровки как описано в работе [13]. Концентрацию ионов натрия в везикулах рассчитывали по формуле

[Na+]цит = Kd×k×(R – Rmin)/(Rmax – R),

где R – отношение флуоресценции при длинах возбуждающего света 340 нм (F340) и 380 нм (F380); Rmin и Rmax – то же при нулевой и насыщающей концентрации [Na+]цит (150 mM); k – отношение интенсивности флуоресценции при 380 нм для свободного и связанного зонда (2,1 ± 0,1); Kd – равновесная константа диссоциации комплекса зонд-Na, равная 20,8 ± 1,4 мМ [13].

Определение изменений содержания ионов хлора ([Cl-]вн) в изолированных синаптосомах основано на использовании флуоресцентного индикатора Cl-, 6-метокси-N-этилхинолина йодида (MEQ). Условия нагружения зондом, проведения калибровочной процедуры как в работе [14]. Флуоресценция образца везикул в среде, не содержащей хлор ([Cl–]о = 0 мМ), была максимальной (Fmax). Минимальное значение флуоресценции (Fmin) определяли после инкубации везикул в течение 10 мин в присутствии 150 мМ KSCN и 25 мкМ валиномицина. Анион KSCN- вытесняет Cl– из комплекса с красителем, валиномицин служит в качестве ионофора, переносящего KSCN– через плазматическую мембрану в везикулы. Для определения величины константы Штерна‒Волмера экспериментальные данные представляли в координатах Fo/FCl–; [Cl–], где Fo = Fmax – Fmin, FCl– – значение флуоресценции при заданной концентрации ионов хлора в среде ([Cl–]). Везикулярную концентрацию хлора в опытных образцах рассчитывали на основании построенной калибровочной кривой, подставляя экспериментальное значение флуоресценции образцов.

Активацию рецепторов осуществляли путем внесения в суспензию синаптосом, выделенных из вентролатеральных отделов продолговатого мозга, селективных агонистов соответствующих типов рецепторов. Для оценки специфичности выявленных изменений в качестве контроля использовали избирательные антагонисты/ингибиторы изученных в работе рецепторных систем (табл.1).

Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при уровне значимости, равном 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние антиаритмических препаратов пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность 5-HT3-типа рецепторов серотонина оценивали по их действию на Са-ответ синаптосом, индуцированный селективным лигандом 5-HT3-рецепторов хлорфенил-бигуанидом. Добавление к суспензии синапотосом хлорфенил-бигуанида в конечной концентрации 0,1 мкМ приводило к статистически достоверному трехкратному увеличению концентрации свободных ионов кальция. Базальная [Са2+]вн в контрольных пробах составила 84 ± 9 нМ. Избирательный антагонист 5-HT3-типа рецепторов серотонина ондансетрон (1,0 мкМ) полностью устранял эффект селективного агониста хлорфенил-бигуанида. Результаты сравнительного анализа действия пропранолола, амиодарона и верапамила на Са-ответ синаптосом приведены на рис. 1. Видно, что в этих услових только верапамил проявил способность статически значимо уменьшать подъем уровня кальция, опосредованный активацией 5-HT3-типа рецепторов серотонина.

Таблица 1

Использованные в работе специфические лиганды различных типов рецепторов

Тип рецептора

Агонист

Антагонист

5-HT3

Хлорфенил-бигуанид

Ондансетрон

ГАМКA

Мусцимол

Блокатор хлор-ионофора пикротоксин

NMDA

N-метил-D-аспартат

CGS 19755 (мемантин)

P2X

АТФ

 

pic_78.wmf

Рис. 1. Влияние верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на Са-ответ, вызванный агонистом 5-HT3 типа рецепторов серотонина хлорфенил-бигуанидом (А). * – отмечены достоверные изменения (p < 0,05)

Действие пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность ГАМКA-типа рецепторов ГАМК исследовали по их влиянию на изменения концентрации Сl– в синаптосомах, вызванные специфическим лигандом этих рецепторов мусцимолом. Внесение в суспензию синапотосом мусцимола в конечной концентрации 10 мкМ приводило к повышению концентрации свободных ионов хлора до максимального значения 36 мМ. [Сl–]вн в контрольных пробах в отсутствие индуктора составляла 14 ± 4 мМ. Блокатор хлорного ионофора пикротоксин (50 мкМ) подавлял стимулирующий эффект мусцимола. При изучении действия пропранолола, амиодарона и верапамила на Сl-ответ синаптосом достоверных изменений отмечено не было (рис. 2).

Исследование влияния изучаемых антиаритмиков на функциональную активность NMDA типа рецепторов глутамата включало определение их действия на содержание в синаптосомах свободных ионов Na+ и Са2+. Избирательный лиганд этого типа рецепторов N-метил-D-аспартат (3 мкМ) достоверно увеличивал базальные значения концентрации катионов в 2,8 и 1,5 раза соответственно. Сравнительное изучение влияния препаратов на Са- и Na-ответы синаптосом показали, что верапамил и амиодарон значимо уменьшают выраженность Са-ответа на N-метил-D-аспартат (рис. 3). Только в присутствии амиодарона достоверно снижается Na-ответ синаптосом, вызванный активацией NMDA типа рецепторов глутамата (рис. 4). Действие пропранолола на этой модели не зарегистрировано.

pic_79.wmf

Рис. 2. Влияние верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на Сl-ответ, вызванный агонистом ГАМКA-типа рецепторов ГАМК мусцимолом (А)

pic_80.wmf

Рис. 3. Влияние верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на Са-ответ, вызванный агонистом NMDA-типа рецепторов глутамата N-метил-D-аспартатом (А). * – отмечены достоверные изменения (p < 0,05)

pic_81.wmf

Рис. 4. Влияние верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на Nа-ответ, вызванный агонистом NMDA-типа рецепторов глутамата N-метил-D-аспартатом (А). * – отмечены достоверные изменения (p < 0,05)

Эффекты пропранолола, амиодарона и верапамила в отношении функциональной активности P2X пуриновых рецепторов изучали по их влиянию на изменения концентрации Са2+ в синаптосомах, индуцированные 30 мкМ АТФ. Из данных, приведенных на рис. 5, видно, что все изученные соединения достоверно не изменяли Са-ответ синаптосом. Вероятно, этот тип рецепторов не участвует в реализации фармакологического действия указанных препаратов на активность симпатоактивирующего центра продолговатого мозга.

pic_82.wmf

Рис. 5. Влияние верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на Са-ответ, вызванный агонистом P2X-пуриновых рецепторов 30 мкМ АТФ (АТФ). Базальный уровень [Са2+]вн в контроле (К) составлял 95 ± 9 нМ

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о вовлечении различных типов мембранных рецепторов нейромедиаторов/нейромодуляторов ЦНС, сопряженных с ионными каналами, в реализацию центрального действия антиаритмических препаратов амиодарона и верапамила (табл. 2).

Таблица 2

Влияние исследованных антиаритмических препаратов на функциональную активность различных типов рецепторов синаптосом ВЛПМ

Антиаритмик

Тип рецепторов, сопряженных с ионными каналами

5-HT3

ГАМКА

NMDA

P2X

Верапамил

+

 

+

 

Амиодарон

   

+

 

Пропранолол

       

В то же время трудно предположить, что все описанные эффекты этих препаратов обусловлены их прямым взаимодействием с узнающими сайтами рецепторов. Не обладая прямым аффинитетом к NMDA-рецепторам глутамата и 5-HT3-типа рецепторам серотонина, антиаритмические соединения могут оказывать на них модифицирующее/аллостерическое действие, усиливая или ослабляя их способность к связыванию [15]. В свете современных представлений о веществах нового типа, не относящихся к прямым агонистам рецепторов, механизм действия изученных антиаритмических препаратов можно представить как эффект модулятора, аллостерически потенцирующего рецептор лиганда и активатора ионных каналов.

Можно полагать, что под влиянием антиаритмиков происходят конформационные изменения мембранных рецепторов нейромедиаторов/нейромодуляторов, сопряженных с ионными каналами.

Выводы

В результате изучения влияния антиаритмических препаратов пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность рецепторов, сопряженных с ионными каналами, выявлено, что антиаритмик IV класса верапамил лимитирует повышение уровня Ca2+ в синаптосомах вентролатерального отдела продолговатого мозга, опосредованное активацией 5-HT3-типа рецепторов серотонина и NMDA-типа рецепторов глутамата.

Амиодарон (III класс) уменьшает подъем уровня Ca2+ и Na+ в синаптосомах, связанный со стимуляцией NMDA-типа рецепторов глутамата.

Пропранолол (II класс) не оказывает статистически значимого действия на исследуемые типы рецепторов.

Влияние изученных антиаритмических препаратов на функциональную активность рецепторов, сопряженных с ионными каналами, может реализовываться в условиях in vivo преимущественно в виде купирующего действия. Подобный эффект определяется блокадой ионных токов по каналам для катионов (Ca2 + и Na +). По результатам наших исследований такое свойство наиболее характерно для антиаритмического средства IV класса верапамила.

Рецензенты:

Макляков Ю.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии и клинической фармакологии, ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Быков И.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фундаментальной и клинической биохимии, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 19.12.2013.