Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Бактерии вида Ornithobacterium rhinotracheale сравнительно недавно признали в качестве патогенного возбудителя заболевания респираторных путей у значительного числа цыплят и индеек [1, 3, 5].

Первоначально возбудитель орнитобактериоза был описан как Pasteurella-подобный или Kingella-подобный [4] микроорганизм или полиморфная граммотрицательная палочка (PGNR) [1]. В 1994 году было предложено назвать возбудителя Ornithobacterium rhinotracheale (ORT), gen.nov.,sp.nov. По данным от 3 мая 1999 года (Anonymous) род Ornithobacterium относят к семейству Flavobacteriaceae. Посредством генетического метода классифицируют и определяют как Ornithobacterium rhinotracheale (ORT), gen.nov.,sp.nov в rRNA суперсемействе V, находящимся в таксономической близости родов Cytophaga, Riemerella, Flavobacterium, Weekseela, Sporocytophaga, Capnocytophaga [3].

Особенности, характеризующие болезнь, вызываемую орнитобактериями, включают относительно слабые респираторные симптомы у молодых птиц, которые начинаются с чихания и исчезают через 1–2 недели. У погибшей птицы наиболее часто регистрируют аэросаккулиты, одно- или двухсторонние пневмонии, пенистые скопления жидкости в грудной полости, анемичность, перикардиты и перитониты [4].

Заболевание, вызываемое орнитобактериями, может принести значительный экономический ущерб за счет увеличения процента смертности, снижения яйценоскости, снижения вывода птенцов, повышения процента выбраковки и низкого показателя прироста. Для изучения возможности создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза птиц необходимо было изучить биологические свойства этого малоизученного в нашей стране инфекционного агента [5].

Цель и задачи исследования ‒ изучить основные биологические свойства бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на референс-штаммах К 282 и К 33, полученных из музея НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Для достижения поставленной цели необходимо изучить тинкториальные, культуральные и биохимические свойства Ornithobacterium rhinotracheale; подобрать плотные и жидкие питательные среды для культивирования вышеназванных микроорганизмов для наработки бактериальной массы.

Изучение биологических свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale проводилось по классическим методикам [1].

Результаты исследований и их обсуждение

Для изучения возможности создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза птиц необходимо было изучить биологические свойства этого малоизученного в нашей стране инфекционного агента.

Тинкториальные свойства бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale устанавливали путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Граму. Увеличение светового микроскопа составляло ×100×15.

Микроскопию проводили методом негативного контрастирования 1,5 % фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК). Просматривали препараты на электронном микроскопе HV-12A (фирмы Hitachi) при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении 35×103. Фиксировали культуру 2 %-м раствором OsO4.

Результаты микроскопирования O. rhinotracheale представлены на рис. 1.

Рис. 1. Микроскопия O. rhinotracheale К 282 увеличение 35·103

При исследовании морфологических свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale нами было установлено, что это небольшие грамотрицательные палочки с округлыми концами. Споры и капсулы не образуют. Результаты электронной микроскопии, представленные на рис. 1, дают характерную информацию о данном микроорганизме.

При исследовании морфологических свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale нами было установлено, что это небольшие грамотрицательные палочки с округлыми концами. Споры и капсулы не образуют.

Для изучения культуральных свойств использовали тесты, которые наиболее полно характеризуют ферментативные свойства бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale согласно литературным данным [2].

Таким образом, мы получили следующие результаты: интенсивное синее окрашивание дисков для исследования на оксидазу (HiMedia) говорит о положительной реакции на цитохромоксидазу; индол и сероводород не образуют; при добавлении метилового красного кислоту не образуют и окрашивание среды остается желтого цвета; на среде Симмонса цитрат не утилизируют; фермент ДНК-аза не деполимеризует ДНК вокруг культуры и цвет среды остается без изменений; тест окисления/ферментации положительный. При ферментации углеводов производят слабое сбраживание (интенсивное синее окрашивание по ходу укола практически без изменения цвета среды) с образованием газа лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, маннозу, что отражает положительную сторону проведенных тестов. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Длительность исследований по изучению культуральных свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale подтолкнула нас к использованию тест-систем по ускоренной типизации микроорганизмов, произведенных ФГУН НИИЭМ им. Пастера. Нами были получены результаты, отраженные в табл. 2.

Таблица 1

Показатели исследований на биохимические свойства бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale

Примечание: «+» – положительный результат, «–» – отрицательный результат.

Использование тест-систем позволило расширить спектр изученных культаральных свойств референс-штаммов бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale по еще 7 показателям. В результате исследований нами изучены 22 биохимических свойства вышеназванных бактерий.

Изучение протеолитических свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale мы начали с определения гемолитической активности. Определение морфологических и фенотипических факторов на гемолитическую активность проводили на триптозо-соевом агаре (Difko) с добавлением 10 % овечьей и человеческой дефибринированной крови. Для этого культуру предварительно культивировали в течение 48 ч при 37 °С на бульоне Хоттингера. При изучении гемолитической активности бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale было установлено, что независимо от вида донора, чья кровь была использована, зона разрушения эритроцитов не обнаружена.

Следующей целью исследований было проведение сравнительного анализа ростовых характеристик орнитобактерий на различных средах, предлагаемых для оптимального культивирования чистой культуры, что обусловлено получением больших объёмов бактериальной массы для цели наших исследований.

Таблица 2

Показатели ферментативной активности бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale по тест-системе по ускоренной типизации ФГУН НИИЭМ им. Пастера

Примечание: «+» – положительный результат, «–» – отрицательный результат.

Из плотных питательных сред активный рост бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale был кровяном агаре, содержащем 5–10 % дефибринированной овечьей крови. Экспериментально установлено, что его основу могут составлять Blood agar base (bioMerieux, Франция), Purple Broth base (Difco, USA), Tryptose Blood agar base (Difco, USA). Рекомендуется инкубировать на агаре в чашках Петри при 37 °С в течении 48–72 часов в анаэробных или микроаэробных условиях (5–10 % СО2). Слабый рост либо его отсутствие возникает при 24 °С. Установлено, что вышеназванные микроорганизмы растут на триптозо-соевом агаре фирм: (bio Merieux, Франция), Tryptose agar base (Difco, USA), на PPLO агаре (Difco, USA). Из жидких питательных сред оптимум роста предоставляют бульон Хоттингера, сердечно-мозговой экстракт и пептонная вода.

В наших экспериментах по определению оптимальной среды культивирования установлено, что бактерии вида Ornithobacterium rhinotracheale не растут на агаре МакКонки, Дригальского, Эндо, Симмонса.

Оптимальное время культивирования бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на выбранных нами питательных средах – 48 часов. На рис. 2 отражены ростовые характеристики бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на PPLO агаре. Экспериментальным путем было установлено, что ростовые характеристики бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на кровяном агаре, содержащем 5–10 % дефибринированной овечьей крови, триптозо-соевом агаре и PPLO агаре, примерно аналогичны.

Рис. 2. Характеристика роста на обогащенной питательной среде (PPLO агаре) бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale

Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. По результатам экспериментов пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой нами среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода – глюкозу. По результатам опытов сконструирована оптимальная питательная среда накопления для культивирования бактерий O. Rhinotracheale.

Выводы

Охарактеризованы основные биологические свойства бактерий O. rhinotracheale (по данным эмирсионной микроскопии – это короткие палочки с округлыми концами, спор и капсул не образуют; установлено отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; гемолитическая активность не выявлена; при взаимодействии с лактозой, сахарозой, глюкозой, маннозой, маннитом, оксидазой – реакция положительная, при взаимодействии с аргининдекарбоксилазой, лизиндекарбоксилазой, арабинозой, лизином, аргинином, уреазой, адонитом, сорбитом – реакция отрицательная).

Разработана питательная среда для наработки бактериальной массы O. rhinotracheale с целью получения инактивированного антигена: мясопептонный агар – 1000 мл; дрожжевой экстракт – 4,0 г; пептон – 5,0 г; глюкоза – 3,5 г; К2НРО4 – 2,0 г; МgSО4 – 5,0 г.

Рецензенты:

Любин Н.А., д.б.н., профессор, зав. кафедрой морфологии, физиологии и патологии животных, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», г. Ульяновск;

Хайруллин И.Н., д.в.н., профессор кафедры хирургии, акушерства, фармакологии и терапии, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», г. Ульяновск.

Работа поступила в редакцию 19.12.2013.