Ожоговая болезнь и обострение хронического остеомиелита протекают на фоне выраженных изменений в иммунной системе, признаком которых являются изменения в популяционном составе лимфоцитов периферической крови [1, 2, 5, 8]. Для оценки состояния клеточного звена иммунной системы в клинической практике имеет широкое распространение изучение пяти основных популяций лимфоцитов: Т-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и NK-клеток. Вместе с тем становится ясным, что заметную роль в развитии иммунных нарушений могут принимать «редкие» субпопуляции лимфоцитов [6].
Мембранные молекулы CD4 и CD8 являются ко-рецепторами комплекса TСR-CD3 и рассматриваются как основные маркеры определения Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. До недавнего времени считалось, что одновременно CD4 и CD8 появляются на мембране лимфоцитов только на стадии β-селекции при их развитии в тимусе. Обнаружение CD4+CD8+ клеток в периферической крови считалось неким артефактом, связанным с преждевременным выходом незрелых лимфоцитов из тимуса [4, 10] или признаком активации цитотоксических Т-лимфоцитов [9]. К настоящему времени установлено, что представители данной субпопуляции лимфоцитов являются высокодифференцированными клетками памяти [3]. Исследователи выделяют несколько вариантов фенотипа CD4+CD8+ клеток, таких как CD4dimCD8bright (или CD4lowCD8high) и CD4bright CD8dim (CD4highCD8low). Помимо человека фенотип CD4brightCD8dim часто встречается в крови экспериментальных животных: свиней, цыплят, крыс и мышей, приматов [9]. Имеются сведения об увеличении CD4+CD8+ лимфоцитов в периферической крови при различных патологических состояниях, например, мононуклеозе, вызванном вирусом Эбштейна-Барра, ВИЧ-инфекции, хроническом лимфолейкозе, миастении, рассеянном склерозе, идиопатической тромбоцитопенической пурпуре и др. [9]. Значение увеличения количества этих клеток остается во многом необъяснимым, хотя считается, что дубль-позитивные Т-лимфоциты могут иметь большое значение в реакциях адаптивного иммунитета в ответ на различные инфекционные агенты [3]. Сведений о количестве CD4+CD8+ лимфоцитов в периферической крови пациентов с ожоговой травмой и хроническими остеомиелитами, патологиями с ярко выраженными инфекционными процессами в доступной литературе найти не удалось.
Целью данной работы явилось проведение анализа количественного содержания дубль-позитивных Т-клеток и их фенотипа, а также числа CD3+, CD4+и CD8+ лимфоцитов в периферической крови тяжелообожженных больных и пациентов с хроническими остеомиелитами в период обострения заболевания.
Материалы и методы исследования
Исследованы образцы крови 20 пациентов с термической травмой (все пациенты с благоприятным исходом ожоговой болезни) и 20 пациентов с обострением хронического остеомиелита. Возраст больных варьировался от 37 до 75 лет. Все пациенты получали стандартное лечение, включающее оперативные вмешательства и медикаментозную терапию. Специфических иммуномодуляторов не использовали. Образцы для исследований забирали в утренние часы одновременно с плановыми анализами. В качестве образцов использовали цельную кровь из периферической вены с добавлением антикоагулянта ЭДТА-К3. Исследования проводили при поступлении пациентов в стационар (для пострадавших от ожога в период ожогового шока) и перед выпиской больных из стационара после полного курса терапевтических и хирургических мероприятий. В качестве контроля исследовали 10 образцов периферической крови здоровых волонтеров. Анализ выполняли в день поступления образца в лабораторию. Использовался метод многоцветного анализа на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter). В качестве реагентов использовали четырехцветную панель моноклональных антител против CD45 (меченых – FITC), CD4 (меченых –РЕ), CD8 (меченых –ECD) и CD3 (меченных–РС5). Все реагенты производства «Beckman Coulter». Двойная экспрессия CD4 и CD8 выявлялась гейтированием по CD45+ лимфоцитам. Результаты выражали в процентном содержании клеток.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ SPSS-14. При анализе взаимосвязей использовали коэффициент корреляции Пирсона. Уровень статистической значимости принимали равным 0,05. Результаты описаны средним и стандартным отклонением (M ± σ).
Результаты исследования и их обсуждение
В группе здоровых добровольцев содержание CD4+CD8+ клеток в периферической крови было стабильным показателем и составило 0,7 ± 0,2 % от общего количества лимфоцитов, что в целом соответствует литературным данным [3]. Во всех случаях выявлялись клетки как с фенотипом CD4highCD8low, так и CD4lowCD8high в соотношении примерно 1:1.
У пациентов с термической травмой количество дубль-позитивных CD4+CD8+ лимфоцитов практически не отличалось от нормальных значений (табл. 1). Соотношение фенотипов CD4highCD8low и CD4lowCD8high повторяло картину у здоровых добровольцев. Содержание этих клеток и соотношение фенотипов при поступлении и на момент выписки пациента из стационара находилось на одном уровне. Из всей группы ожоговых больных только у одного пациента уровень дубль-позитивных лимфоцитов на момент поступления превысил нормальные значения в четыре раза и оставался таковым к моменту выписки из стационара. Из сопутствующих заболеваний у пострадавшего выявлен хронический бронхит, который, вероятно, и мог послужить причиной повышения содержания клеток памяти в крови. Одновременно у других пострадавших, имевших подобное сопутствующее заболевание, бронхит не сопровождался повышением количества изучаемых клеток. Можно предположить, что ожоговая травма и проводимое по этому поводу лечение не приводили к количественному изменению CD4+CD8+ клеток в периферической крови обожженных.
Содержание Т-лимфоцитов, их основных субпопуляций и показатель иммунорегуляторного индекса также не имели достоверных различий от нормальных показателей в указанные сроки исследования.
Проведенный корреляционный анализ не выявил достоверных взаимоотношений между количеством CD4+CD8+ клеток и уровнем других изучаемых показателей.
Таблица 1
Содержание субпопуляций лимфоцитов в крови тяжелообожженных пациентов (%)
|
Показатель |
Норма |
При поступлении |
Перед выпиской |
|
CD3+ клетки |
70 ± 5,3 |
70,0 ± 7,1 |
69,9 ± 9,4 |
|
CD4+ клетки |
41,5 ± 5,7 |
43,9 ± 7,4 |
45,0 ± 9,8 |
|
CD8+ клетки |
27,4 ± 3,4 |
24,7 ± 7,2 |
25,4 ± 7,0 |
|
CD4/CD8 |
1,5-2,6 |
1,9 ± 0,7 |
1,9 ± 1,0 |
|
CD4+CD8+ клетки |
0,7 ± 0,2 |
0,9 ± 0,9 |
0,9 ± 1,0 |
У пациентов с обострением хронического остеомиелита содержание CD4+CD8+ лимфоцитов в периферической крови имело тенденцию к увеличению как по сравнению с нормальными значениями, так и по сравнению с ожоговыми (табл. 2).
Таблица 2
Содержание субпопуляций лимфоцитов в крови пациентов с остеомиелитом (%)
|
Показатель |
Норма |
При поступлении |
Перед выпиской |
|
CD3+ клетки |
70 ± 5,3 |
76,7 ± 6,6 |
78,4 ± 4,6 |
|
CD4+ клетки |
41,5 ± 5,7 |
45,4 ± 7,7 |
48,6 ± 8,4 |
|
CD8+ клетки |
27,4 ± 3,4 |
28,6 ± 9,9 |
32,4 ± 8,7 |
|
CD4/CD8 |
1,5-2,6 |
1,7 ± 0,7 |
1,6 ± 0,6 |
|
CD4+CD8+ клетки |
0,7 ± 0,2 |
1,7 ± 1,9 |
1,9 ± 2,0 |
Также как и у ожоговых пациентов, количество дубль-позитивных клеток в периферической крови оставалось одинаковым как при поступлении, так и на момент выписки пациента. При этом в данной группе больных преобладал фенотип CD4highCD8low в соотношении 3:1. Особенно ярко преобладание данного фенотипа выявлялось при высоком содержании CD4+CD8+ лимфоцитов (рисунок).
Пример высокого содержания дубль-позитивных лимфоцитов с фенотипом CD4highCD8low в периферической крови пациента с хроническим остеомиелитом. На гистограммах А и Б показана интенсивность флоурисценции для молекул CD4 и CD8 соответственно
В группе пациентов с обострением хронического остеомиелита у девяти пациентов обнаружено повышенное содержание дубль-позитивных лимфоцитов. У одного пациента высокие показатели CD4highCD8low клеток выявлены при повторной госпитализации спустя четыре месяца после выписки из стационара, т.е. содержание этих клеток остается стабильным как в период обострения, так и период ремиссии основного заболевания. Не было выявлено зависимости количества CD4+CD8+ клеток от возраста, времени нахождения в стационаре и частоты обострений основного заболевания, что частично подтверждает данные Lambert C at al. [7].
Содержание Т-лимфоцитов и их основных субпопуляций имело тенденцию к увеличению перед выпиской пациентов по сравнению с первыми днями после госпитализации. Вероятно, это является реакцией на проведение курса антибиотикотерапии и санации гнойного очага, что приводит к снижению аутоинтоксикации.
Корреляционный анализ не выявил взаимосвязей содержания в периферической крови CD4+CD8+ клеток и CD3+, CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а также иммунорегуляторного индекса.
Заключение
Таким образом, полученные результаты указывают на то, что ожоговая болезнь и обострение хронического остеомиелита не оказывают существенного влияния на уровень в крови CD4+CD8+ клеток, соответственно количество этих лимфоцитов в периферийном кровотоке больных определяется преморбидным фоном. Среди пациентов с хроническими остеомиелитами повышено число лиц с увеличением содержания в крови дубль-позитивных лимфоцитов по сравнению с ожоговыми больными и здоровыми добровольцами, а также преобладает фенотип CD4highCD8low. При изучаемых патологиях содержание CD4+CD8+ клеток не имеет корреляционных взаимоотношений с количеством CD3+, CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Не удалось выявить зависимости количества CD4+CD8+ клеток и их фенотипа от возраста больных, тяжести течения основного заболевания и частоты обострений хронического остеомиелита (для данной категории пациентов). Вероятно, роль, которую могут играть эти клетки в механизмах противоинфекционного иммунитета при развитии ожоговой болезни и хронического остеомиелита еще предстоит выяснить.
Рецензенты:
Новиков В.В., д.б.н., профессор, директор НИИ молекулярной биологии и региональной экологии, ФГОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
Контрощикова К.Н., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики, ФПВК «Нижегородская государственная медицинская академия», г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 30.11.2013.