Чтобы осуществить свое действие на метаболизм глюкозы после поступления в циркуляцию, инсулин связывается со специфическими рецепторами на мембранах клеток. Дефект инсулинового действия развивается вследствие нарушения связывания гормона, а также ухудшения образования вторичного посредника инсулинового действия, уменьшения транспорта глюкозы в клетку или дистальных дефектов основных ферментов, участвующих в утилизации глюкозы [5, 4].
Развивающийся ацидоз на фоне гипергликемии при СД у детей нарушает течение многих ферментативных реакций в организме и вместе с тем активирует некоторые фосфолипазы и протеазы, что ведет к усилению распада фосфолипидов и белков и к повышению концентрации ненасыщенных жирных кислот и усилению их перекисного окисления.[3]. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) усиливается, и в результате подавления и истощения антиоксидантной системы из-за активации распада и торможения ресинтеза белковых компонентов данной системы. Продукты ПОЛ, в свою очередь, усугубляют нарушение структуры и функции мембран, в том числе и инсулинсвязывающую функцию. В результате формируется гипоксический тип метаболизма, резко усугубляющий течение СД у детей.
Тяжесть течения у детей и подростков СД типа 1 (СД 1) характеризуется быстрым развитием гипоксии и других метаболических осложнений, патогенез которых по-прежнему остается изученным недостаточно.
Целью работы является изучение состояния энергетического обмена и зависимость между активностью инсулиновых рецепторов и уровнями АТФ крови у детей, больных сахарным диабетом.
Материалы и методы исследования
При сахарном диабете у детей проводили комплексное исследование липидного состава сыворотки и мембран клеток крови, степени переокисления липидов, инсулинсвязывающую активность (ИСА) клеток крови, а также состояние ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ). Обследовано 70 детей в возрасте 3–15 лет с сахарным диабетом 1 и 2 типа, в контрольную группу были включены 26 практически здоровых детей, не предъявляющих в момент обследования жалоб. 27 детей страдали СД 1, длительность которого варьировалась от 1 года до 10 лет. Степень компенсации СД была определена с учетом содержания глюкозы в сыворотке крови утром натощак и концентрации гликированного гемоглобина (Hb A1с). Компенсацию углеводного обмена у детей считали при показателе Hb A1с ниже 7,0 %. 17 детей 13–15 лет страдало СД 2 типа (СД 2). Показатели метаболизма глюкозы у них указывали на декомпенсированное течение заболевания (средний уровень Hb A1с – 12,6 %, суточная гликемия – 11,26 ммоль/л, доза инсулина 0,95 Ед/кг). Больные СД 1 дети получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме (от 0,35 до 1,66 Ед/кг). При СД 2 типе дети также получали корригирующую углеводный обмен терапию (препараты групп сульфонилмочевины и бигуанидов).
Липиды мембран эритроцитов экстрагировали хлороформ-метаноловой смесью по методу J. Folch et al. 1957 [11]. Общее содержание липидов в мембране эритроцитов определяли методом Тарановой Н.А., 1987 [8]. Препаративное разделение общих липидов проводили методом тонкослойной хроматографии [Финдлей Дж.Б., Эванз У.Г., 1990] [9] в системе растворителей гептан:диэтиловый эфир:этилацетат (в соотношении 80:20:1,5) на пластинках «Sorbfil» (Россия). Разделение фракций фосфолипидов мембран эритроцитов методом тонкослойной хроматографии по Прохоровой М.И., 1982 [7] осуществляли в системе хлороформ:метанол:вода (в соотношении 32:12,5:2) на пластинках «Sorbfil» (Россия). Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов (фирма «Sigma», США). Количественную оценку хроматограмм проводили с помощью разработанной компьютерной программы.
Эритроциты, отделенные от плазмы, отмывали троекратным центрифугированием в среде Хэнкса без кальция и магния с рН 7,3 на центрифуге Multifuge 1S/ IS-R Германия) при 1900 g в течение 10 мин. Утилизацию глюкозы клетками крови определяли в среде, содержащей 2∙109 кл/мл отмытых эритроцитов, инкубированных с возрастающими концентрациями нативного инсулина [6]. О количестве глюкозы, потребленной клетками, судили по разнице концентрации глюкозы в среде до и после инкубации. Активность инсулиновых рецепторов исследовали по связыванию 125I – инсулина с лимфоцитами, полученными из цельной крови в одноступенчатом градиенте фиколла-верографина по методу Boum [10] и с эритроцитами, отмытыми трёхкратно, по ранее описанному нами методу [4]. Концентрацию АТP и лактата в периферической крови определяли с помощью наборов фирмы «Boehringer», активность Na+, K+–Ca2+-АТPазы определяли по модифицированному методу [2].
Данное исследование одобрено комитетом по этике РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Дети и их родители давали информированное согласие на участие в данном исследовании.
Оценку хроматограмм проводили с помощью разработанной компьютерной программы.
Результаты исследования обрабатывали при помощи t-критерия Стьюдента. Приведена среднеарифметическая ± ошибка средних показателей. Различия считали достоверными при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
У больных СД 1 липидный спектр сыворотки крови характеризовался повышением концентрации общего ХС и повышением индекса атерогенности. При этом выраженность метаболических нарушений у пациентов с СД 1 зависела от длительности диабета, стадии компенсации углеводного обмена и наличия сосудистых осложнений: было отмечено выраженное повышение содержания общего ХС у пациентов с течением заболевания более 5 лет или с сосудистыми осложнениями. Пациенты с СД 2 характеризовались более выраженными и разнообразными отклонениями показателей липидного обмена (табл. 1). Повышение содержания общего холестерина и триацилглицеридов в сыворотке крови сопровождалось снижением холестерина ЛПВП.
Механизмы развития гиперхолестеринемии при сахарном диабете связаны с нарушением гормональной регуляции, так как инсулярная недостаточность может быть связана не только с нарушением углеводного и липидного обмена, но и повышением уровня контринсулярных гормонов [1] и, следовательно, нарушением всех видов обмена веществ. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания ЛПОНП. Как полагают, повышение образования ЛПОНП в печени происходит благодаря увеличенному поступлению жирных кислот [12], а также отсутствию ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП.
Таблица 1
Изменение некоторых метаболических показателей крови у больных сахарным диабетом типа 1 и 2 (X ± m)
|
Показатель |
Контрольная группа |
Больные сахарным диабетом типа 1 |
Больные сахарным диабетом типа 2 |
|
ЛПВП, мг/дл |
292,8 ± 11,3 |
236,89 ± 9,8 p1 > 0,05 |
295,17 ± 15,4 p1 > 0,05; p2 > 0,05 |
|
ЛПНП, мг/дл |
457,06 ± 16,1 |
435,71 ± 12,5 p1 > 0,05 |
533,31 ± 23,4 p1 > 0,05; p2 > 0,05 |
|
ЛПОНП, мг/дл |
53,47 ± 3,9 |
53,45 ± 4,9 p1 > 0,05 |
124,85 ± 13,2 p1 < 0,01; p2 < 0,01 |
|
Общий холестерин, мг/дл |
169,63 ± 11,5 |
258,06 ± 9,8 p1 < 0,05 |
303,80 ± 10,4 p1 < 0,001; p2 < 0,01 |
|
Общие триглицериды, мг/дл |
150,39 ± 9,3 |
119,38 ± 8,7 p1 > 0,05 |
213,67 ± 11,5 p1 < 0,001; p2 < 0,01 |
|
ХС/ФЛ |
0,911 ± 0,26 |
0,960 ± 0,03 p1 < 0,01 |
0,960 ± 0,09 p1 < 0,01; p2 > 0,05 |
|
ХС ЛПВП, мг/дл |
57,87 ± 8,7 |
43,91 ± 7,1 p1 < 0,05 |
48,13 ± 7,2 p1 < 0,05; p2 > 0,05 |
|
Активность Nа+, K+- ATPазы, мкМольPi/час·мг белка |
0,107 ± 0,04 |
0,032 ± 0,03 p1 < 0,05 |
0,061 ± 0,03 p1 < 0,05; p2 > 0,05 |
|
АТP, мкМоль/л |
621 ± 26,8 |
364,7 ± 17,6 p1 < 0,01 |
317,8 ± 17,9 p1 < 0,01 |
|
МДА в плазме, мкмоль/мл |
0,75 ± 0,03 n = 26 |
1,16+0,03 p1 < 0,001 n = 6 |
1,18 ± 0,01 p1 < 0,001 n = 16 |
Примечания: p1 – уровень значимости различий по сравнению со значениями в контрольной группе; p2 – уровень значимости различий по сравнению со значениями у пациентов сахарным диабетом типа 1. ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ЛПОНП-липопротеины очень низкой плотности, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ХС ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности.
Как показало проведенное нами исследование, в мембранах эритроцитов у больных СД угнетена активность Na+, K+-ATPазы (табл. 1). Не исключено, что снижение активности Na+, K+-ATPазы является результатом структурной модификации липидного матрикса мембран эритроцитов у больных СД детей, вследствие повышения интенсивности свободно-радикальных процессов в мембранах клеток, о чём свидетельствуют высокие значения МДА (p < 0,001) (табл. 1). Структурно-функциональными изменениями в липидном бислое мембран эритроцитов можно объяснить уменьшение потребления глюкозы и синтеза АТP в клетках тканей организма.
Вышеуказанные изменения приводят к достоверному снижению активности инсулиновых рецепторов как эритроцитарных мембран, так и лимфоцитов, и не только при СД типа 2, но и при СД типа 1 (табл. 2).
При исследовании зависимости между активностью инсулиновых рецепторов в эритроцитах и лимфоцитах и уровнями АТФ крови у детей, больных СД с трудным достижением фазы компенсации в динамике у 35 детей с лабильным течением сахарного диабета, получающих инсулин в дозе от 0,6 до 1,0 ед./кг массы тела, показало выраженную тенденцию к снижению уровня АТФ крови (277,77 ± 17,43 мкмоль/л, p < 0,05 по сравнению с контролем) (табл. 2).
Низкий уровень АТФ крови отражает его недостаточное содержание в клетках, т.к. АТФ проходит через клеточные мембраны. У больных с синдромом хронической передозировки гормона через 1 час после завтрака с предварительным введением инсулина уровень АТФ еще больше снижался в отличие от больных в фазе декомпенсации, но без признаков передозировки инсулина (соответственно 228,52 ± 29,15 и 372,33 ± 41,76 мкмоль/л, p < 0,02). Очевидно, что у больных первой группы имеется недостаток эффектов инсулина на метаболизм. Исследование активности инсулиновых рецепторов у этих детей показало снижение специфического связывания инсулина лимфоцитами (20,68 ± 4,0 %, контроль – 40,05 ± 3,8 %, p < 0,05). Выявленная положительная зависимость между сниженным уровнем АТФ крови и специфическим связыванием инсулина лимфоцитами ( r = 0,45, p < 0,05 ) свидетельствует о развитии у детей с тяжелым СД типа I в фазе декомпенсации инсулинрезистентности, особенно выраженной при синдроме хронической передозировки инсулина, на фоне низкого уровня АТФ крови.
Таблица 2
Изменение содержания АТФ, активности инсулиновых рецепторов клеток крови и Na+, K+-ATФазы в эритроцитах у детей при сахарном диабете типа 1 и 2 (X ± m)
|
Группа больных |
АТФ крови, мкМоль/л |
ИСА в эритроцитах, % |
ИСА в лимфоцитах, % |
Активность Nа+, K+-ATФазы, мкМольPi/час·мг белка |
Утилизация глюкозы эритроцитами, (2⋅109) Кл/ч |
|
Контроль |
621 ± 26,8 |
29,1 ± 3,9 |
40,05 ± 3,8 |
0,107 ± 0,04 |
1,09 ± 0,015 |
|
СД типа I |
364,7 ± 17,43 p < 0,05 |
22,6 ± 2,1 p > 0,05 |
20,68 ± 4,05 p < 0,05 |
0,032 ± 0,03 P < 0,05 |
0,88 ± 0,03 |
|
СД типа II |
317,8 ± 17,9 |
17,5 ± 3,6 |
19,4 ± 4,9 |
0,42 ± 0,42 |
0,82 ± 0, 016 |
Примечание. p – уровень достоверности различий по сравнению со значениями в контрольной группе.
Как показало проведенное исследование, в мембранах эритроцитов у больных СД угнетена активность Na+, K+-ATФазы (табл. 1), что может указывать на нарушение структуры и функции мембраны в процессах активного транспорта ионов. Функционирование мембранной Na+, K+-ATФазы связано с гидролизом значительного количества АТФ.
Проведенное исследование состояния инсулиновых рецепторов на фоне дислипидемии показало, что у больных с лабильным течением СД 1 и значительным снижением инсулиносекреции имеет место снижение инсулинсвязывающей активности (ИСА) лимфоцитами. Так, ИСА в лимфоцитах у таких детей составляло 31,61 ± 3,9 %; в контрольной группе – 47, 9 ± 5,9 % (p < 0,001), что также подтверждает предположение о влиянии уровня ПОЛ на окислительную модификацию мембран клеток.
Выводы
1. В основе метаболической недостаточности у детей, больных СД, лежат нарушения структурно-функциональных свойств в мембрано-рецепторном аппарате клеток, сопровождающиеся снижением уровня АТP, угнетением активности мембраносвязанного фермента Na+,K+-АТPазы, резким снижением инсулинсвязывающей активности рецепторов и уменьшением потребления глюкозы клетками, что свидетельствует о снижении чувствительности клеток к инсулину.
2. СД у детей протекает с нарушением липидного обмена, активацией процессов липидной пероксидации, приводящей к изменению структурно-функциональных свойств мембран клеток.
Рецензенты:
Торховская Т.И., д.б.н., ведущий научный сотрудник, ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ ИБМХ РАМН), г. Москва;
Белова О.В., д.б.н., заведующая лабораторией молекулярной иммунологии и биохимии, ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства (ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России), г. Москва.
Работа поступила в редакцию 30.11.2013.