Уровень естественной резистентности организма во многом определяет течение физиологических и патологических реакций, в том числе и при заживлении ран кожи. Достаточно часто возникают ситуации, требующие стимуляции репаративных процессов с учетом разных аспектов действия терапевтического средства [3, 7]. При повреждениях различного генеза в тканях развивается стереотипный воспалительно-репаративный процесс, имеющий общие закономерности и характеризующийся рядом последовательно сменяющихся стадий. В настоящее время весьма актуальным является оценка регулирующего действия иммунной системы посредством цитокинов на процессы жизнедеятельности биологических систем. Цитокины координируют все этапы развития воспаления и адекватность ответа на внедрение патогена, обеспечивая его отграничение и удаление, а затем и полноценную репарацию поврежденной структуры тканей [2, 11]. При этом необходимо, чтобы воспаление как защитная реакция организма протекало в темпе и объеме, соответствующем степени повреждения.
Цитокины представляют собой сложный комплекс эндогенных иммунорегуляторных молекул [8]. Отдельные и комбинированные вещества цитокинового ряда являются основой для создания естественных и рекомбинантных иммуномодулирующих фармакологических средств. «Суперлимф», избранный для наших исследований, является комплексом естественных цитокинов, продуцируемых in vitro при индукции мононуклеаров периферической крови свиней Т-митогеном – фитогемагглютинином. «Суперлимф» представляет собой стандартизованный естественный комплекс природных иммунопептидов молекулярной массой менее 40 000 Da, содержащий такие цитокины, как интерлейкины IL-1, IL-2, IL-6, факторы, ингибирующие миграцию фагоцитов, некроза опухоли, трансформирующий фактор роста [5]. Препарат выпускается в стерильном лиофилизированном виде в ампулах, содержащих 0,1 мг активного вещества и 5 мг стабилизатора полиглюкина. «Суперлимф» производства ООО «Центр иммунотерапии «Иммунохелп» (Россия, регистрационное удостоверение № РМ002447/01-2003 выдано Министерством здравоохранения РФ от 12.05.2003 г.) предназначен для местного и наружного применения.
Цель наших исследований состояла в комплексном морфологическом изучении специфики влияния аппликаций препарата «Суперлимф» на заживление ран по сравнению со спонтанным течением репаративного процесса в коже.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на 60 белых крысах-самцах линии «Вистар» средней массой 150 г, которые содержались и выводились из эксперимента в соответствии с международными рекомендациями и соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным. Под эфирным наркозом им наносились полнослойные дефекты кожи площадью 225 мм2 на спинной поверхности тела. Крысы были разделены на две группы. Группу 1 (опытную) составили животные, на раневые дефекты которых ежедневно наносили препарат «Суперлимф» (сухое вещество ампулы разводилось в 2 мл физиологического раствора) по 1 капле один раз в сутки в течение пяти дней, первая аппликация препарата проводилась сразу после нанесения повреждения. На раны крыс группы 2 (контрольной) наносили физиологический раствор по той же схеме. Для оценки воспалительной фазы регенерации исследовались отпечатки, полученные с поверхности раневого дефекта через 6, 12 и 24 часа наблюдения после нанесения травмы. Отпечатки подсушивались на воздухе, фиксировались метиленовым синим по Май-Грюнвальду и окрашивались азур-эозином согласно методике Романовского. Количество нейтрофилов и макрофагов в цитограммах подсчитывалось в световом микроскопе в 10 полях зрения при 1000-кратном увеличении.
Для изучения морфологических изменений тканей регенерата на ультраструктурном уровне на третьи сутки после операции брались биоптаты, которые фиксировались в глютаровом альдегиде, заливались в аралдит и изучались под электронным микроскопом LVEM5. Скорость сокращения ареала раневой поверхности оценивали планиметрическим методом. Во всех случаях анализа количественных данных для определения значимости различий средних величин использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование цитологического состава раневого экссудата показало, что первыми клетками, заселяющими рану, являлись нейтрофилы, и на протяжении всего срока изучения они преобладали количественно. В препаратах, полученных через 6 часов после нанесения травмы, нейтрофильные гранулоциты исчислялись десятками, тогда как макрофаги выявлялись единично в поле зрения. Наряду с этим обращало на себя внимание отличие в качественных и количественных характеристиках клеточных элементов раневого экссудата у животных разных экспериментальных групп (табл. 1).
Таблица 1
Динамика изменения (M ± m) клеточного состава раневого экссудата
|
Группы животных |
Нейтрофилы |
Макрофаги |
||
|
количество |
диаметр |
количество |
диаметр |
|
|
Через 6 часов после операции |
||||
|
1 |
117,9* ± 20,3 |
9,8 ± 0,8 |
4,5* ± 0,6 |
9,4* ± 1,5 |
|
2 |
48,8 ± 11,3 |
6,7 ± 0,7 |
0 |
0 |
|
Через 12 часов после операции |
||||
|
1 |
382,7* ± 31,2 |
10,9* ± 0,9 |
12,1* ± 1,2 |
13,2* ± 1,5 |
|
2 |
127,0 ± 22,3 |
7,7 ± 0,5 |
3,6 ± 0,3 |
9,2 ± 0,8 |
|
Через 24 часа после операции |
||||
|
1 |
108,1 ± 18,3 |
11,2 ± 6,9 |
21,2 ± 5,6 |
11,2 ± 3,1 |
|
2 |
110,5 ± 19.2 |
8,1 ± 4.9 |
14,9 ± 2.3 |
11,8 ± 2.9 |
Примечание: * различия достоверны по сравнению с группой 2 при р ≤ 0,05.
У животных группы 1 аппликации препарата «Суперлимф» непосредственно после операции вызывали более активную миграцию нейтрофилов и макрофагов в рану. Через 6 часов наблюдения в раневом экссудате нейтрофилов в 2,4 раза больше, чем у животных контрольной группы. Кроме нейтрофилов в цитограммах обнаруживались единичные макрофаги – ключевые клетки репаративного процесса. В отпечатках крыс группы 1 насчитывалось 4,5 ± 0,6 этих клеток, в то время как в группе плацебо они еще не обнаруживались. Микроорганизмы заселяли раневое поле и находились вне- и внутриклеточно у животных обеих экспериментальных групп.
Через 12 часов после нанесения дефекта в отделяемом ран количество нейтрофильных гранулоцитов у животных группы 1 увеличилось в 3,2 раза до 382,7 ± 31,2 клеток, тогда как у крыс группы 2 увеличение произошло в 2,6 раза и составило лишь 127,1 ± 22,3 клеток (различия достоверны). Количество макрофагов возросло до 12,1 ± 1,2 против 3,6 ± 0,3 в контроле. К этому времени в цитограммах крыс группы 1 микроорганизмы встречались только в единичных полях зрения и преимущественно внутриклеточно. В отделяемом ран контрольной группы животных микробная флора обнаруживалась преимущественно внеклеточно в среднем в 7 полях зрения из 10.
К концу первых суток наблюдения (через 24 часа после нанесения раны) активность воспалительного процесса у крыс группы 1 резко снизилась, на что указывало значительное уменьшение числа нейтрофильных гранулоцитов до 108,1 ± 18,3 и появление клеток с признаками апоптоза, в то время как у животных без лечения количество лейкоцитов уменьшилось незначительно. Интенсивность миграции макрофагов продолжала увеличиваться у животных обеих групп, но при применении «Суперлимфа» их насчитывалось в 1,4 раза больше, чем в контрольной. Дальнейшее цитологическое исследование не представлялось возможным из-за образования струпа, своеобразной «биологической повязки», защищающей подлежащие ткани от вредного воздействия окружающей среды и предотвращающей потерю тканевой жидкости.
Исследование под электронным микроскопом биоптатов регенерирующей ткани крыс группы 1 на третьи сутки после травмы показало, что значительное количество нейтрофилов находилось в состоянии некроза, о чем свидетельствовали поврежденная цитоплазматическая мембрана и стертый рисунок ядерного хроматина клеток. Ультраструктурные изменения макрофагов характеризовались признаками функционального возбуждения, такими как набухание, увеличение объема их ядер. Ядерный хроматин был равномерно распределен по всей площади ядра, ядрышки располагались эксцентрично. Каналы гранулярного эндоплазматического ретикулума значительно расширены, отмечались признаки активации фагоцитарного аппарата. В цитоплазме макрофагов наблюдались скопления большого числа вторичных лизосом, обнаруживалось много остаточных телец.
По результатам планиметрии у животных группы 1 при применении «Суперлимфа» после нанесения раневого дефекта рубец образовался к 13 дню, тогда как у контрольной группы крыс к 15 дню еще сохранялся струп средней площадью 4 мм2.
Анализ полученных результатов показал, что противовоспалительные цитокины препарата «Суперлимф» активизируют хемотаксис нейтрофилов, вызывают их более выраженную функциональную активность уже с первых часов репаративного процесса. Вероятно, «Суперлимф» усиливает адгезию нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов к эндотелию путем увеличения экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 и VCAM-1 с последующим выходом этих клеток из сосудистого русла в очаг повреждения [6, 13]. Это ведет к бурной воспалительной реакции и быстрому очищению раневого поля от инфекционных агентов. Однако противовоспалительный компонент лекарственного средства не дает процессу принять гиперэргический характер с аутолизом неповрежденных тканей. «Суперлимф» усиливает фагоцитарную активность макрофагов и способствует антибактериальной защите организма [1, 4, 14]. В работах [9, 10, 12] обосновывается мнение о том, что такие цитокины, как TNF-α, IL-1 и IL-6 вызывают ряд морфологических и молекулярных изменений, приводящих к индукции притока мононуклеарных фагоцитов в очаг поражения и, как следствие, к локализации воспаления.
Заключение
Влияние аппликаций «Суперлимфа» на течение первой фазы репаративного процесса, исследованного на ультрамикроскопическом и клеточном уровнях, проявляется в оптимизации воспалительной реакции, делая ее более интенсивной с первых часов, но ограничивая продолжительность этой стадии. «Суперлимф» создает благоприятные условия для последовательного осуществления этапов посттравматической регенерации, стимулирует регенеративный потенциал и позволяет локализовать патоморфологические изменения, что приводит к сокращению срока заживления ран кожи данной площади и локализации на 3 дня.
Рецензенты:Чекмарёва И.А., д.б.н., заведующая лабораторией электронной микроскопии, ФГБУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского» Министерства здравоохранения РФ, г. Москва;
Дубровин И.А., д.м.н., доцент, профессор кафедры судебной медицины ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ, г. Москва.