Биохимические изменения в организме при травме костей и, в частности, альвеолярной кости освещены в ряде работ различного времени с точки зрения патогенеза, диагностики, эффективности лечения [1, 3, 4, 9], а не с точки зрения разработки прогностических критериев исходов травматического повреждения костей с целью своевременной коррекции возможных осложнений. Если учесть, что травма в клинике возникает в большинстве случаев на фоне других заболеваний, нарушенной реактивности, в том числе метаболического характера, становится очевидным, что разработка таких критериев должна начинаться с эксперимента. Следует отметить, что изучение биохимических показателей обычно привязывается к подтверждению воспроизведенных в эксперименте нарушений костной системы [3] без учета стадийности репаративного остеогенеза. Видимо, поэтому исследователи не находят ожидаемых изменений в определенный отрезок времени.
Целью нашего исследования явилось сравнительное изучение кинетики классических биохимических критериев травмы кости (кальций, фосфор, щелочная фосфатаза) и современных показателей повреждения и заживления (провоспалительные цитокины) на моделях посттравматической регенерации альвеолярной кости у крыс. Для реализации цели исследования стандартное травматическое повреждение альвеолярной кости наносили двум группам крыс: без костной патологии и с остеопорозом.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на 70 половозрелых крысах-самцах линии WAG. Животные были разделены на 4 группы: группа 1 – интактные; группа 2 – остеопороз, вызванный введением дексаметазона из расчета 1,675 мг/кг 1 раз в сутки внутримышечно в течение 2 недель [11]; группе 3 и 4 наносили травматическое повреждение нижней челюсти в виде перфорационного (сквозного дырчатого) дефекта диаметром 2 мм [7]. До проведения операции группе 3 вводили внутримышечно физиологический раствор в объеме, эквивалентном раствору дексаметазона, ежедневно в течение 2-х недель, группе 4 – дексаметазон в дозе 1,675 мг/кг ежедневно внутримышечно в течение 2-х недель. Оперативное вмешательство осуществляли под общим наркозом (аминазин 10 мг/кг, кетамин 50 мг/кг) в условиях асептики и антисептики. Крыс 3-й и 4-й групп выводили из эксперимента на 7, 14, 28 и 45 сутки после травмы с соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для исследовательских и других научных целей. Сроки исследования были выбраны соответственно стадийности репаративного остеогенеза у крыс [5].
Для определения кальция и фосфора применяли фотометрические методы с использованием коммерческих наборов фирмы Филисит-Диагностика (Украина). Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли кинетическим методом с р-нитрофенолфосфатом. Содержание ИЛ-1α и ИЛ-8 в периферической крови определяли иммуноферментными методами на иммуноферментном анализаторе «Labline-90» (Австрия) согласно прилагаемой инструкции.
Результаты исследований обрабатывали стандартными методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием прикладных программ «Stadiа-6» [2].
Результаты исследования и их обсуждение
Доказательства нарушений альвеолярной кости остеопоретического характера, возникших под влиянием двухнедельного введения дексаметазона, приведены в наших ранних работах [6, 7]. При этом обнаружены сдвиги в активности ЩФ, уровне метаболитов оксида азота при неизмененном содержании Са и Р в крови. Некоторые из этих данных отражены в табл. 1–3 (группа 2, остеопороз).
Как следует из данных, представленных в табл. 1, направленность изменений содержания кальция в сыворотке крови животных 3 и 4 групп после травмы однотипна. Однако при этом на 7 сутки содержание кальция в крови животных 3 группы (травма нижней челюсти) не изменяется, а в 4 группе (травма нижней челюсти на фоне остеопороза) достоверно нарастает в сравнении с интактными животными, видимо, за счет большого масштаба разрушений кости под влиянием дексаметазона.
На 14 сутки содержание кальция в обеих группах достоверно снижается по сравнению с интактными крысами, скорее всего, за счет минерализации, отмеченной в этой стадии репаративного остеогенеза [5]; оно остается сниженным и на 28 сутки в обеих группах, однако повышается по сравнению с 14 сутками (табл. 1). На 45 сутки концентрация кальция в крови в обеих группах вновь нарастает как в сравнении с нормой, так и относительно предыдущего срока (28 сутки), видимо, в связи с резорбцией избыточного регенерата на стадии ремоделирования костного регенерата [9]. Обращает на себя внимание тот факт, что ни в одном из сроков наблюдений достоверных отличий в содержании кальция в крови между 3 и 4 группами не выявлено.
Таблица 1
Содержание кальция (ммоль/л) в сыворотке крови крыс после травмы альвеолярной кости
|
Группы |
Сроки наблюдения |
||||
|
7 сут |
14 сут |
28 сут |
45 сут |
||
|
Группа 1 (интактные) |
2,28 ± 0,12 (n = 8) |
||||
|
Группа 2 (остеопороз) |
2,60 ± 0,26 (n = 12) |
||||
|
Группа 3 (травма нижней челюсти) |
2,27 ± 0,37 (n = 6) |
1,38 ± 0,10 (n = 6) Р1 < 0,05 Р3 < 0,05 |
1,79 ± 0,40 (n = 6) Р1 < 0,05 |
3,07 ± 0,29 (n = 6) Р1 < 0,05 Р3 < 0,05 |
|
|
Группа 4 (остеопороз + травма нижней челюсти) |
2,74 ± 0,37 (n = 6) Р1 < 0,05 |
1,37 ± 0,06 (n = 6) Р1 < 0,05 Р3 < 0,05 |
1,76 ± 0,16 (n = 7) Р1 < 0,05 |
2,90 ± 0,28 (n = 7) Р1 < 0,05 Р3 < 0,05 |
|
Примечание. Здесь и в табл. 2–5:
Р1 – достоверно относительно интактной группы;
Р2 – достоверность между группами 3 и 4;
Р3 – достоверно относительно предыдущего срока.
Еще более монотонная картина прослеживается в отношении содержания фосфора в сыворотке крови (табл. 2). Различий в его концентрации между 3 и 4 группами не обнаружено на всем протяжении исследования.
Таблица 2
Содержание фосфора (ммоль/л) в сыворотке крови крыс после травмы альвеолярной кости
|
Группы |
Сроки наблюдения |
||||
|
7 сут |
14 сут |
28 сут |
45 сут |
||
|
Группа 1 (интактные) |
1,62 ± 0,14 (n = 8) |
||||
|
Группа 2 (остеопороз) |
1,62 ± 0,21 (n = 12) |
||||
|
Группа 3 (травма нижней челюсти) |
1,67 ± 0,04 (n = 6) |
1,93 ± 0,08 (n = 6) Р1 < 0,05 Р3 < 0,05 |
1,69 ± 0,07 (n = 6) Р3 < 0,05 |
1,76 ± 0,16 (n = 6) |
|
|
Группа 4 (остеопороз + травма нижней челюсти) |
1,79 ± 0,11 (n = 6) |
1,81 ± 0,15 (n = 6) |
1,71 ± 0,15 (n = 7) |
1,74 ± 0,11 (n = 7) |
|
Полученные данные вполне сопоставимы с клиническими исследованиями биохимических показателей пациентов с переломами нижней челюсти [4]. Успешное лечение пациентов препаратами, стимулирующими репаративный остеогенез, не вызывало достоверных изменений в содержании кальция и фосфора в ротовой жидкости этих пациентов в сравнении с группой больных с затяжным течением процесса, получавших традиционную терапию.
Динамика изменений активности ЩФ в группах представлена в табл. 3. В 3 группе к концу первой недели после нанесения травмы активность энзима достоверно снижается в сравнении с интактными животными (на 38,7 %), но уже к концу второй недели повышается до максимальных значений, превышая показатели интактной группы на 37,7 %. В сроки максимальной активности ЩФ, как показали наши исследования, повышается уровень неорганического фосфора (табл. 2), что согласуется с данными клиники [1,9]. В последующем (28–45 сутки) происходит прогрессирующее снижение активности ЩФ. У животных 4 группы следует отметить особенности изменений активности ЩФ по сравнению с 3 группой. Первое – активность ЩФ достоверно повышается (на 32,6 %) еще до нанесения травмы, что может быть расценено только как нарушение процессов ремоделирования кости под влиянием дексаметазона; увеличение активности ЩФ в костной ткани на преднизолоновой модели остеопороза у крыс найдено и другими исследователями [8].
Таблица 3
Активность щелочной фосфатазы (Е/л) в сыворотке крови крыс после травмы альвеолярной кости
|
Группы |
Сроки наблюдения |
||||
|
7 сут |
14 сут |
28 сут |
45 сут |
||
|
Группа 1 (интактные) |
321,22 ± 97,43 (n = 8) |
||||
|
Группа 2 (остеопороз) |
425,91 ± 73,81 (n = 12) Р1 < 0,05 |
||||
|
Группа 3 (травма нижней челюсти) |
196,83 ± 27,61 (n = 6) Р1 < 0,05 |
442,35 ± 42,28 (n = 6) Р1 < 0,05 Р3 < 0,02 |
266,47 ± 28,29 (n = 6) Р3 < 0,05 |
203,46 ± 22,26 (n = 6) Р1 < 0,05 |
|
|
Группа 4 (остеопороз + травма нижней челюсти) |
299,28 ± 55,40 Р2 < 0,05 (n = 6) |
288,13 ± 32,17 (n = 6) Р2 < 0,05 |
313,42 ± 33,11 (n = 7) |
246,74 ± 30,48 (n = 7) Р1 < 0,05 Р3 < 0,05 |
|
Второе – не отмечается максимального подъема активности ЩФ на 14 сутки, как это было в 3 группе. Активность ЩФ в крови после травмы в этой группе не отличается от таковой у интактных крыс, достоверно снижаясь только на 45 сутки. Хотя изменения активности ЩФ при посттравматической регенерации альвеолярной кости в условиях применения дексаметазона имеет свою специфику, достоверные отличия в активности фермента в сравнении с 3 группой имеют место только на 7 и 14 сутки после повреждения, поэтому вряд ли определение активности ЩФ может быть надежным критерием прогнозирования процессов остеорепарации при травме челюстно-лицевой области даже при достаточно «грубых» нарушениях остеогенеза, в частности, вызванных введением дексаметазона. Более того, полученные данные невозможно однозначно трактовать без сопоставления с патоморфологическими исследованиями альвеолярной кости.
Определение провоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс показало, что у животных 3 группы в ответ на механическую травму уровень ИЛ-1α и ИЛ-8 максимально повышался на 14 сутки, превышая норму (интактные крысы) в 3,1 раза и 1,3 раза соответственно (табл. 4 и 5). Во все остальные сроки колебания в содержании цитокинов находились в пределах нормы.
В ответ на механическую травму челюсти у животных с остеопорозом (4 группа) уровень ИЛ-1α в крови достоверно повышался как в сравнении с нормой, так и с показателями 3 группы во все исследуемые сроки после травмы: 7–45 сутки (табл. 4).
Таблица 4
Содержание ИЛ-1α в сыворотке крови крыс после травмы альвеолярной кости
|
Группы |
Сроки наблюдения |
||||
|
7 сут |
14 сут |
28 сут |
45 сут |
||
|
Группа 1 (интактные) |
1,87 ± 0,42 (n = 8) |
||||
|
Группа 2 (остеопороз) |
2,39 ± 0,28 (n = 12) Р1 < 0,05 |
||||
|
Группа 3 (травма нижней челюсти) |
1,62 ± 0,26 (n = 6) |
5,82 ± 0,52 (n = 6) Р1 < 0,01 Р3 < 0,02 |
2,24 ± 0,19 (n = 6) Р3 < 0,05 |
1,57 ± 0,13 (n = 6) Р3 < 0,05 |
|
|
Группа 4 (остеопороз + травма нижней челюсти) |
3,33 ± 0,34 (n = 6) Р1 < 0,05 Р2 < 0,02 |
8,12 ± 0,79 (n = 6) Р1 < 0,001 Р2 < 0,05 Р3 < 0,001 |
3,01 ± 0,49 (n = 7) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 Р3 < 0,02 |
2,40 ± 0,23 (n = 7) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 Р3 < 0,05 |
|
Уровень ИЛ-8 в сыворотке крови крыс 4 группы превышал норму с 14 суток и до конца исследования (табл. 5). В эти же сроки мы обнаруживали достоверное повышение содержания цитокина в сравнении с 3 группой, что свидетельствует о хронизации процессов заживления альвеолярной кости после травмы на фоне остеопороза [3].
Полученные данные подтверждают, что при оценке остеорепарации в большей мере необходимо полагаться на маркеры органического обмена, чем минерального [10]. Вместе с тем полагаем, что диагностические и прогностические биохимические критерии регенерации при травмах челюстно-лицевой области на этапе разработки требуют привлечения методов морфологического анализа, что и составит задачу наших будущих исследований.
Выводы
1. Классические, биохимические маркеры метаболизма костной ткани – кальций, фосфор, щелочная фосфатаза ‒ не являются достоверными прогностическими критериями процессов остеорепарации при травмах альвеолярного отростка.
2. Более надежными критериями нарушения процессов посттравматической регенерации альвеолярной кости в эксперименте являются провоспалительные цитокины ИЛ-1α и ИЛ-8.
Таблица 5
Содержание ИЛ-8 в сыворотке крови крыс после травмы альвеолярной кости
|
Группы |
Сроки наблюдения |
||||
|
7 сут |
14 сут |
28 сут |
45 сут |
||
|
Группа 1 (интактные) |
20,87 ± 1,13 (n = 8) |
||||
|
Группа 2 (остеопороз) |
25,55 ± 2,88 (n = 12) Р1 < 0,05 |
||||
|
Группа 3 (травма нижней челюсти) |
25,49 ± 2,28 (n = 6) |
27,50 ± 2,98 (n = 6) Р1 < 0,05 |
24,86 ± 2,13 (n = 6) |
24,64 ± 2,92 (n = 6) |
|
|
Группа 4 (остеопороз + травма нижней челюсти) |
24,49 ± 2,08 (n = 6) |
32,08 ± 3,22 (n = 6) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 Р3 < 0,05 |
30,84 ± 3,24 (n = 7) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 |
30,41 ± 3,9 (n = 7) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 |
|
Рецензенты:
Жуков В.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологической химии, Харьковский национальный медицинский университет МЗ Украины, г. Харьков;
Сорокина И.В., д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии, Харьковский национальный медицинский университет МЗ Украины, г. Харьков.
Работа поступила в редакцию 05.12.2013.