На настоящий момент гипертоническая болезнь (ГБ) является пандемией 21 века, обусловлена повсеместной распространенностью, жизнеугрожающими осложнениями, высокими показателями смертности и инвалидизации трудоспособного населения [11]. В настоящее время проведено множество эпидемиологических и экспериментальных работ по изучению этиопатогенеза ГБ, в которых установлены широкий спектр кандидатных генов предрасположенности к ГБ, однако по-прежнему остаются невыясненными ведущие пусковые молекулярно-генетические механизмы развития заболевания [14].
Гипертоническая болезнь является мультифакториальной полигенной патологией, развитие которой определяется сложным характером взаимодействия множества генов с различными факторами окружающей среды [10]. К модифицируемым факторам риска развития ГБ относятся: курение, употребление алкоголя, стрессы, гиподинамия, атеросклероз, избыток соли, ожирение. К немодифицируемым можно отнести пол, возраст, наследственность, факторы окружающей среды. Установлено, что в качестве факторов окружающей среды могут выступать различные виды химических соединений [14].
Выявлено более 5 миллионов химических веществ, воздействию которых постоянно подвергается человек (атмосферные поллютанты, пестициды, фармацевтические препараты, косметика, пищевые добавки, вредные привычки и др. По этой причине приобретает актуальность идентификации в различных популяциях специфичных генов и средовых факторов, взаимодействие которых формирует норму реакции устойчивости человека и его адаптацию к изменяющейся среде. В этой связи наиболее подходящими генетическими маркерами являются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), экспрессия которых регулируется влияниями средовых факторов. Биотрансформация ксенобиотиков представляет собой принципиальный механизм поддержания постоянства гомеостаза при воздействия на организм чужеродных химических соединений. В системе биотрансформации принято выделять 3 фазы метаболизма. Цитохром CYP1A2 является одним из ключевых ферментов 1 фазы биотрансформации, играет важную роль в окислении многочисленных соединений как эндогенного (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, простагландины, лейкотриены, биогенные амины), так и экзогенного (лекарства, яды, продукты промышленного загрязнения, пестициды, канцерогены, мутагены и т.п.) происхождения [6]. Кроме того, цитохром CYP1A2 может усиливать токсическое действие кофеина, афлотоксина и ацетаминофена.
В работах зарубежных исследователей показано влияние полиморфизма гена CYP1A2 на риск развития профессионального бронхита [9], риска рака эндометрия и рака молочной железы [1, 2] и доказана роль генетического полиморфизма CYP1A2 и курения на риск развития гепатоцеллюлярной карциномы [5]. Целью работы явилось изучение вклада полиморфизма A154C гена CYP1A2 в формировании предрасположенности к гипертонической болезни и изучение особенностей взаимодействия генотип-среда в формировании предрасположенности к ГБ.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужила популяционная выборка неродственных индивидов жителей Центрального района России. Всего было обследовано 560 больных гипертонической болезнью и 480 здоровых лиц контрольной группы. Формирование групп больных ГБ происходило на базе кардиологического отделения Областной клинической больницы и Больницы скорой медицинской помощи в периоды с 2003–2004 [12], 2008–2009, 2011–2012 гг. Пациенты включались в соответствующую группу больных после установления окончательного диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Критерием включения индивидов в контрольную группу было отсутствие у них хронических заболеваний. По полу и возрасту больные ГБ не отличались от контрольной группы (р < 0,05). Было проведено анкетирование пациентов на предмет выявления факторов риска развития болезни с использованием оригинальных анкет, разработанных на кафедре биологии, медицинской генетики и экологии. С помощью анкетирования исследовались влияния факторов внешней среды (образ жизни, наличие вредных привычек, особенности питания и др.). Подробности анкетирования были описаны нами ранее [12]. В исследовании использовались методы клинического и лабораторно-инструментального обследования пациентов, молекулярно-генетические и генетико-статистические методы.
У обследуемых проводился забор крови из кубитальной вены в пластиковые пробирки с 0,5 М раствором ЭДТА (рН = 7,8) в количестве 5 мл. Потом кровь замораживали и хранили при – 20 °С. ДНК было выделено методом стандартной фенол-хлороформной экстракции. Анализ изучаемых локусов осуществлялся с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК в режиме real time на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Были подобраны необходимая структура праймеров и зондов, использованных для генотипирования: F: 5’-CTCAGATTCTGTGATGCTCAAAGG -3’;R: 5’-CCAGAAAGACTAAGCTCCATCTACCA -3’; 5’-FAM TCCTGG-LNA-GCCCACAGA -RTQ1-3’;5’-ROX-CGTCCTGT-LNA-GCCCAC–BHQ2-3’ [http://variantgps.nci.nih.gov/cgfseq/pages/home.do]. Для генотипирования полиморфизма A154C гена CYP1A2 были подобраны соответствующие условия ПЦР. Температура денатурации составляла 95,0° в течение 4 мин, температура отжига с учетом средних температур подобранных праймеров и зондов составила 55,5°, температура элонгации составляла 95,0° в течение 15 с. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца геномной ДНК с концентрацией 15–20 нг/мл. В реакционную смесь входили следующие компоненты: деионизорованная вода, MgCl2 25 мМ, 0,4 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфов (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), по 0,1 мкл каждого праймера, по 0,05 мкл каждого зонда и 0,4 мкл Taq-полимеразы.
Для сравнения частот аллелей и генотипов между группами больных и здоровых людей также использовали критерий Хи-квадрат с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к гипертонической болезни судили по величине отношения шансов (OR) с 95 % доверительным интервалом (95 %CI). Во всех случаях уровень статистической значимости принимали за 95 % (р < 0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
Распределение частот генотипов изучаемого полиморфизма и его соответствие популяционному равновесию Харди‒Вайнберга проводилось раздельно в группе больных гипертонической болезнью и в контрольной группе. Установлено, что статистически значимых отклонений в полиморфизме A154C гена CYP1A2 ни в группе больных ГБ, ни в группе контроля выявлено не было (р > 0,05).
Следующим этапом исследования стало изучение ассоциации гена CYP1A2 с риском развития гипертонической болезни. Результаты сравнительного анализа частот аллелей и генотипов у вышеописанного гена для больных гипертонической болезнью представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, аллели и генотипы полиморфизма A154C гена CYP1A2 не были ассоциированы с риском развития гипертонической болезни.
Таблица 1
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма A154C гена CYP1A2 у больных гипертонической болезнью и здоровых индивидов
|
Аллели |
Частоты аллелей |
Критерий различий χ2, (p) |
OR (95 %CI) |
|
|
Больные |
Контроль |
|||
|
154C |
0,703 |
0,675 |
2,11 (0,15) |
0,88 (0,74-1,05) |
|
154A |
0,297 |
0,235 |
||
|
Генотипы |
Частоты генотипов |
Критерий различий χ2, (p) |
OR (95 %CI) |
|
|
Больные (n = 602) |
Контроль (n = 547) |
|||
|
154CC |
0,51 |
0,473 |
1,53 (0,22) |
0,86 (0,69-1,09) |
|
154CA |
0,385 |
0,402 |
0,41 (0,52) |
0,93 (0,73-1,17) |
|
154AA |
0,105 |
0,125 |
0,91 (0,94) |
0,84 (0,58-1,2) |
Примечание. * – достоверно при р < 0,05.
Учитывая возможность полового диморфизма подверженности ГБ, представлялось важным провести стратифицированный анализ ассоциаций полиморфизма A154C гена CYP1A2 раздельно у женщин и мужчин. Результаты сравнительного анализа частот аллелей и генотипов в зависимости от пола представлены в табл. 2.
Таблица 2
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма A154C гена CYP1A2 у больных гипертонической болезнью и здоровых индивидов в зависимости от пола
|
Аллели |
Частоты аллелей |
|||||||
|
женщины |
мужчины |
женщины |
мужчины |
|||||
|
Больные |
Контроль |
Больные |
Контроль |
Критерий различий χ2, (p) |
OR (95 %CI) |
Критерий различий χ2, (p) |
OR (95 %CI) |
|
|
154C |
0,942 |
0,880 |
0,713 |
0,667 |
7,4*(0,01) |
0,45 (0,23–0,87) |
3,38 (0,07) |
0,8 (0,61–1,01) |
|
154A |
0,058 |
0,120 |
0,287 |
0,333 |
||||
|
Генотипы |
Частоты генотипов |
Критерий различий χ2, (p) |
OR (95 %CI) |
Критерий различий χ2, (p) |
OR (95 %CI) |
|||
|
Больные (n = 130) |
Контроль (n = 117) |
Больные (n = 323) |
Контроль (n = 332) |
|||||
|
154CC |
0,9 |
0,82 |
0,52 |
0,45 |
1,53 (0,22) |
0,51 (0,24–1,07) |
2,05 (0,15) |
0,8 (0,59–1,09) |
|
154CA |
0,084 |
0,12 |
0,39 |
0,42 |
0,41 (0,52) |
0,68 (0,3–1,56) |
0,21 (0,64) |
0,93 (0,68–1,27) |
|
154AA |
0,016 |
0,06 |
0,09 |
0,13 |
0,91 (0,94) |
0,25 (0,05–1,21) |
2,54 (0,11) |
0,66 (0,4–1,1) |
Примечание. * – достоверно при р < 0,05.
Было установлено, что аллель 154A ассоциировался с пониженным риском развития гипертонической болезни у женщин, хотя и статистически значимых ассоциаций генотипов полиморфизма A154C гена CYP1A2 не наблюдалось. Проведенный аналогичный анализ в группе мужчин не дал значимых результатов.
Важной задачей работы был анализ ассоциации полиморфизма A154C гена CYP1A2 с развитием гипертонической болезни в зависимости от условий среды прооксидантной и антиоксидантной природы. С этой целью для оценки прооксидантного воздействия на организм использовались данные о курении, полученные при анкетировании обследуемых. В качестве модели антиоксидантного действия было выбрано употребление свежих овощей и фруктов – естественных источников природных антиоксидантов.
В табл. 3 представлены сведения о количестве курильщиков в обследуемых группах. По данному критерию не было установлено достоверных различий по количеству курильщиков как в общей группе, так и отдельно у мужчин и женщин в выборке больных в сравнении с теми же группами контроля.
Таблица 3
Распределение здоровых и больных гипертонической болезнью в зависимости от курения
|
Статус – курение |
Независимо от пола |
Мужчины |
Женщины |
|||
|
Больные ГБ (n = 543) |
Здоровые (n = 336) |
Больные ГБ (n = 288) |
Здоровые (n = 196) |
Больные ГБ (n = 256) |
Здоровые (n = 133) |
|
|
Некурящие |
393 (70,4) |
223 (67,8) |
147 (50,6) |
96 (28,9) |
239 (92,6) |
127 (95,4) |
|
Курящие |
150 (29,2) |
113 (32,2) |
141 (49,4) |
100 (30,1) |
17 (7,4) |
6 (4,5) |
|
c2 (p)* |
3,57 (0,06) |
0,20 (0,66) |
0,71 (0,40) |
|||
Примечание. * – критерии значимости различий между группами относительно курения здоровых и больных.
Таблица 4
Влияние курения на риск развития ГБ в зависимости от генотипов CYP1A2
|
Генотипы |
Больные ГБ |
Больные ГБ мужчины |
Больные ГБ женщины |
|||
|
Некурящие, (n = 393) P (OR,95 %CI) |
Курящие, (n = 159) P(OR, 95 %CI) |
Некурящие, (n = 148) P(OR, 95 %CI) |
Курящие, (n = 148) P(OR, 95 %CI) |
Некурящие, (n = 245) P (OR, 95 %CI) |
Курящие, (n = 11) P(OR, 95 %CI) |
|
|
154CC |
0,36 (1,13; 0,87–1,46) |
0,36 (1,18; 0,83–1,69) |
0,18 (1,3; 0,88–1,92) |
0,23 (1,27; 0,86–1,87) |
0,88 (0,97; 0,67–1,39) |
0,78 (1,19; 0,35–4,01) |
|
154CA |
0,23 (1,18; 0,9–1,54) |
0,47 (0,88; 0,61–1,25) |
0,3 (1,23; 0,83–1,84) |
0,83 (0,96; 0,65–1,43) |
0,77 (1,06; 0,72–1,55) |
0,58 (0,71; 0,21–2,91) |
|
154AA |
0,72 (0,93; 0,63–1,37) |
0,01* (2,68; 1,26–5,7) |
0,63 (1,16; 0,63–2,15) |
0,02* (2,47; 1,13–5,14) |
0,51 (0,83; 0,49–1,43) |
0,21 (1,14; 0,85–1,52) |
Установлено, что вариантный генотип 154AA гена CYP1A2 был ассоциирован с повышенным риском развития ГБ у пациентов курильщиков (OR = 2,68 95 %CI 1,26–5,7 p = 0,01), однако стратифицированный по полу анализ показал, что риск развития ГБ имеет место только у мужчин-носителей данного генотипа (OR = 2,47 95 % CI 1,13–5,14 p = 0,02) (табл. 4).
Несмотря на то, что изучаемый полиморфизм не показал выраженных ассоциаций с риском развития гипертонической болезни, при анализе курения установлено, что число курящие мужчины-носители вариантного генотипа 154AA CYP1A2 имели повышенный риск развития болезни. Выявленная особенность согласуется с литературными данными, которые свидетельствуют о важной роли курения в развитии ГБ. Известно, что цитохром CYP1A2 конститутивно экспрессируется в печени и синтезируется под действием циклических ароматических углеводородов, в том числе содержащихся в сигаретном дыме: бензопирен и специфические нитрозамины. В процессе детоксикации ксенобиотиков при нормальном функционировании цитохром CYP1A2 обладает окислительной активностью. По данным зарубежных источников, у носителей генотипа СС отмечается снижение ферментативной активности [4, 6], следовательно, происходит неполное окисление ПАУ и накопление токсических промежуточных метаболитов. Таким образом, на фоне недостаточного функционирования цитохрома CYP1A2 происходит усиление активации прооксидантного действия, нарушающее функционирование системы в сторону развития оксидативного стресса. Такое состояние, в свою очередь, может привести к развитию эндотелиальной дисфункции (путем непосредственного повреждения эндотелия сосудов и нарушения синтеза вазоактивных аминов) и дезактивации симпатадреналовой системы (вследствие нарушения процесса стероидогенеза) и, как следствие, развитию искомого заболевания.