Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

FINDING A NEW (8TH) GENOTYPE OF BLV IN VARIOUS REGIONS OF THE WORLD

Vafin R.R. 1, 2 Khazipov N.Z. 1 Shaeva A.Y. 1 Zakirova Z.R. 1 Zaynullin L.I. 2 Tyulkin S.V. 3 Abdulina I.R. 2, 3 Alimov A.M. 1
1 Kazan state academy of veterinary medicine
2 Kazan (Volga Region) Federal University
3 Tatar trans-regional veterinarian laboratory
The aim of this study was to systematize data about bovine leukemia virus isolates (BLV) case detection in different regions of the world, belonging to new 8th BLV genotype according modern phylogenetic classification of this pathogen, the existence of which is justified by domestic and foreign researchers. According to the results of the use of the basic local alignment search tool (BLAST) was found the presence of nucleotide sequences of 20 isolates of the 8th BLV genotype, deposited in GenBank NCBI. The BLV isolates of 8th genotype were detected in cattle from different regions of the world: Croatia, Ukraine, Russia and Jordan. This paper presents the results of an extended phylogenetic analysis of env-gene locus nucleotide sequences of 8th BLV genotype isolates, deposited in GenBank NCBI at a given time.
BLV
genotype
PCR
sequencing
phylogenetic analysis
classification
1. Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M., Tagirov M.Sh., Uchenye zapiski KGAVM, 2011, Vol. 208, pp. 330–337.
2. Shaeva A.Y., Garaeva Z.R., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Alimov A.M., Uchenye zapiski KGAVM, 2012, Vol. 211, pp. 192–197.
3. Ababneh M.M., Al-Rukibat R.K., Hananeh W.M., Nasar A.T., Al-Zghoul M.B., Arch. Virol., 2012, Vol. 157, no. 12, pp. 2343–2348.
4. Balic D., Lojkic I., Periskic M., Bedekovic T., Jungic A., Lemo N., Roic B., Cac Z., Barbic L., Madic J., Arch. Virol., 2012, Vol. 157, no. 7, pp. 1281–1290.
5. Beier D., Blankenstein P., Marquardt O., Kuzmak J., Berl Munch Tierarztl Wochenschr., 2001, Vol. 114, no. 7–8, pp. 252–256.
6. Fechner H., Blankenstein P., Looman A.C., Elwert J., Geue L., Albrecht C., Kurg A., Beier D., Marquardt O., Ebner D., Virology, 1997, Vol. 237, no. 2, pp. 261–269.
7. Licursi M., Inoshima Y., Wu D., Yokoyama T., González E.T., Sentsui H., Virus Res., 2002, Vol. 86, no. 1–2, pp. 101–110.
8. Matsumura K., Inoue E., Osawa Y, Okazaki K. Virus. Res., 2011, Vol. 155, no. 1, pp. 343–348.
9. Moratorio G., Obal G., Dubra A., Correa A., Bianchi S., Buschiazzo A., Cristina J., Pritsch O., Arch. Virol., 2010, Vol. 155, no. 4, pp. 481–489.
10. Rodriguez S.M., Golemba M.D., Campos R.H., Trono K., Jones L.R., J. Gen. Virol., 2009, Vol. 90, no. 11, pp. 2788–2797.
11. Rola-Luszczak M., Pluta A., Olech M., Donnik I., Petropavlovskiy M., Gerilovych A., Vinogradova I., Choudhury B., Kuzmak J., PLoS One, 2013, Vol. 8, no. 3, available at: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0058705.

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническое вирусное заболевание опухолевой природы, возбудителем которого является РНК-содержащий онкогенный вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus – BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae.

Подходы к таксономической классификации ВЛКРС, выстраиваемые исключительно на молекулярно-генетических принципах идентификации возбудителя, за последние два десятилетия претерпели значительные изменения, начиная от различных стратегий типизации, основанных на интерпретации генерируемых ПЦР-ПДРФ-профилей [5, 6, 7], заканчивая современной оценкой генотипического разнообразия BLV на основе филогенетического анализа локуса env-гена данного вирусного патогена [9, 10, 11].

Цель настоящей работы – систематизация информационных данных о фактах выявления в различных регионах мира изолятов ВЛКРС, относящихся согласно современной филогенетической классификации данного возбудителя к новому (8-му) генотипу BLV.

Материалы и методы исследования

Экстракция общей ДНК из цельной (консервированной ЭДТА) крови крупного рогатого скота проводилась с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б», согласно инструкции производителя («ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора МЗ РФ).

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV применялась модификация «nested» ПЦР с использованием набора внешних (env5032 + env5608) и внутренних (env5099 + env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию локуса env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 5, 6, 7].

Секвенирование продукта амплификации локуса env-гена выявленного изолята провируса BLV «N174» выполнено на приборе «ABI-300» ((Applied. Biosystems, США) в лабораториях НПО «СибЭнзим» (Россия, г. Новосибирск), остальных пяти изолятов 8-го генотипа ВЛКРС («N006», «N063», «N089», «N121» и «N142») – на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия, г. Москва) с использованием олигонуклеотидов «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных праймеров.

Секвенированные последовательности локуса env-гена выявленных нами изолятов 8-го генотипа ВЛКРС: «N174» (JF713455), «N006» (KC867140), «N063» (KC886616), «N089» (KC886624), «N121» (KC886631), «N142» (KC886634) выравнены по длине 400 нуклеотидов c соответствующими последовательностями типовых представителей известных генотипов BLV, используя программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и MEGA-4, с последующим филогенетическим анализом.

Результаты исследования и их обсуждение

По результатам использования поисковой программы основного локального выравнивания (BLAST), установлено наличие 20 депонированных в GenBank NCBI нуклеотидных последовательностей изолятов нового (8-го) генотипа ВЛКРС.

Перечень этих изолятов BLV с указанием идентификационных номеров доступа (GenBank A/N), начальной даты отправки информации для депонирования в GenBank нуклеотидных последовательностей локуса env-гена провируса, включая регион выявления возбудителя, отражен в табл. 1.

Таблица 1

Перечень изолятов 8-го генотипа ВЛКРС, чьи нуклеотидные последовательности локуса env-гена депонированы в GenBank NCBI

№ п/п

Генотип

Изолят

GenBank A/N

Дата отправки в GenBank

Регион выявления

Ссылка

1

8-й

M1/ELG_Cro/08

GU724606

08-FEB-2010

Хорватия

[4]

2

8-й

4–6

HM563764

17-JUN-2010

Украина

[11]

3

8-й

4–1

HM563766

17-JUN-2010

Украина

[11]

4

8-й

3–43

HM563767

17-JUN-2010

Украина

[11]

5

8-й

2–48

HM563768

17-JUN-2010

Украина

[11]

6

8-й

N174

JF713455

19-MAR-2011

Россия (Татарстан)

[1, 2]

7

8-й

ELG_Cro/BEM/08

JN990069

03-NOV-2011

Хорватия

[4]

8

8-й

ELG_Cro/OSA/08

JN990070

03-NOV-2011

Хорватия

[4]

9

8-й

ELG_Cro/ORA/09

JN990071

03-NOV-2011

Хорватия

[4]

10

8-й

ELG_Cro/VRA/09

JN990072

03-NOV-2011

Хорватия

[4]

11

8-ой

ELG_Cro/MIT/09

JN990073

03-NOV-2011

Хорватия

[4]

12

8-й

ELG_Cro/BIO/10

JN990074

03-NOV-2011

Хорватия

[4]

13

8-й

MKC2137

JQ675759

15-FEB-2012

Россия (Московская обл.)

14

8-й

MKC3511

JQ675760

15-FEB-2012

Россия (Московская обл.)

15

8-й

BLV-Jor-10

JX120612

24-APR-2012

Иордания

[3]

16

8-й

N006

KC867140

06-APR-2013

Россия (Татарстан)

Данная статья

17

8-й

N063

KC886616

10-APR-2013

Россия (Татарстан)

Даннаястатья

18

8-й

N089

KC886624

11-APR-2013

Россия (Татарстан)

Данная статья

19

8-й

N121

KC886631

11-APR-2013

Россия (Татарстан)

Данная статья

20

8-й

N142

KC886634

11-APR-2013

Россия (Татарстан)

Данная статья

Построенная на основании филогенетического анализа локуса env-гена дендрограмма типовых представителей известных генотипов ВЛКРС представлена на рисунке.

В хронологическом порядке самым первым представителем 8-го генотипа ВЛКРС, депонированным в GenBank NCBI, является изолят «M1/ELG_Cro/08» (GU724606), выявленный в Хорватии. Информация о его генотипической принадлежности, включая еще шесть депонированных хорватскими исследователями изолятов («ELG_Cro/BEM/08», «ELG_Cro/OSA/08», «ELG_Cro/ORA/09», «ELG_Cro/VRA/09», «ELG_Cro/MIT/09», «ELG_Cro/BIO/10») нового генотипа BLV, опубликована в работе D. Balic et al. (2012) [4].

Примечательно, что в том же томе (Vol. 157) журнала Archives of Virology, где публиковались хорватские исследователи [4], но в более позднем его номере (№ 12) вышла статья ученых из Иордании и Саудовской Аравии [3], посвященная детекции и молекулярной характеристике вируса лейкоза крупного рогатого скота, обнаруженного в Иордании. M.M. Ababneh et al. (2012) [3] тогда в своей работе охарактеризовали выявленный ими иорданский изолят «BLV-Jor-10» (JX120612) как принадлежащий новому, ранее не классифицированному генотипу BLV.

pic_27.wmf

Дендрограмма типовых представителей известных генотипов ВЛКРС, построенная на основании филогенетического анализа локуса env-гена [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 62 seq.]. Обозначения: черный круг – изоляты 8-го генотипа BLV, выявленные у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ

Следует отметить, что в вышеперечисленных работах [3, 4] авторы обосновывали существование нового генотипа ВЛКРС только на примере своих выделенных изолятов, без сравнительного анализа с другими представителями ВЛКРС, также входящими в филогенетический кластер данного нового генотипа, среди которых к тому времени уже были депонированные в GenBank NCBI нуклеотидные последовательности локуса env-гена изолятов, выявленных в Украине («3-43», «4-1», «2-48», «4-6») и России («N174»).

В 2013 г. M. Rola-Luszczak et al. [11] в своей статье подтвердили факт существования нового генотипа BLV, проведя филогенетический анализ хорватских, украинских и российского («N174», GenBank A/N: JF713455) изолятов, за исключением иорданского. Также этим коллективом авторов [11] было предложено именовать данный новый генотип BLV «8-ым» генотипом, уточняя при этом, что филогенетическая классификация на основе UPGMA-метода, предложенная ранее японскими исследователями [8] и уже предусматривавшая существование 8-го генотипа возбудителя, является некорректной.

В настоящей же работе представлены результаты расширенного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей локуса env-гена изолятов 8-го генотипа ВЛКРС (рисунок), депонированных в GenBank NCBI на данный момент времени, включая анализ соответствующих последовательностей пяти новых изолятов провируса, обнаруженных нами у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ («N006», «N063», «N089», «N121», «N142»; депонированы в GenBank в 2013 г.), а также двух изолятов BLV («МКС2137» и «МКС3511»; депонированы в GenBank в 2012 г.), выявленных на территории Московской области РФ отечественными учеными из Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко.

Следует подчеркнуть, что все же первое упоминание обоснования факта существования нового 8-го генотипа BLV было изложено в нашей ранней публикации 2011 года [1] с содержащейся в ней информацией, что «...изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входят изученные другими исследователями близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (GenBank A/N: HM563766); «3-41» (GenBank A/N: HM563767]) и Хорватии [«M1/ELG_Cro/08» (GenBank A/N: GU724606)] соответственно» [1].

Заключение

Изоляты нового 8-го генотипа ВЛКРС выявлены в различных регионах мира: Хорватии, Украине, России, Иордании; их нуклеотидные последовательности локуса env-гена депонированы в GenBank NCBI в период с 2010 по 2013 год (GU724606, HM563764, HM563766, HM563767, HM563768, JF713455, JN990069, JN990070, JN990071, JN990072, JN990073, JN990074, JQ675759, JQ675760, JX120612, KC867140, KC886616, KC886624, KC886631, KC886634).

Первая информация об обосновании 8-го генотипа BLV описана в нашей ранней статье 2011 года выпуска [1], с независимым подтверждением факта существования нового (8-го) генотипа ВЛКРС в чуть более поздних публикациях зарубежных и отечественных ученых, вышедших в свет в 2012–2013 годах [3, 4, 11].

Рецензенты:

Госманов Р.Г., д.в.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, г. Казань;

Ахметов Т.М., д.б.н., доцент кафедры технологии животноводства Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 09.10.2013.