Лейкоз крупного рогатого скота – хроническое вирусное заболевание опухолевой природы, возбудителем которого является РНК-содержащий онкогенный вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus – BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae.
Подходы к таксономической классификации ВЛКРС, выстраиваемые исключительно на молекулярно-генетических принципах идентификации возбудителя, за последние два десятилетия претерпели значительные изменения, начиная от различных стратегий типизации, основанных на интерпретации генерируемых ПЦР-ПДРФ-профилей [5, 6, 7], заканчивая современной оценкой генотипического разнообразия BLV на основе филогенетического анализа локуса env-гена данного вирусного патогена [9, 10, 11].
Цель настоящей работы – систематизация информационных данных о фактах выявления в различных регионах мира изолятов ВЛКРС, относящихся согласно современной филогенетической классификации данного возбудителя к новому (8-му) генотипу BLV.
Материалы и методы исследования
Экстракция общей ДНК из цельной (консервированной ЭДТА) крови крупного рогатого скота проводилась с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б», согласно инструкции производителя («ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора МЗ РФ).
При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV применялась модификация «nested» ПЦР с использованием набора внешних (env5032 + env5608) и внутренних (env5099 + env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию локуса env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 5, 6, 7].
Секвенирование продукта амплификации локуса env-гена выявленного изолята провируса BLV «N174» выполнено на приборе «ABI-300» ((Applied. Biosystems, США) в лабораториях НПО «СибЭнзим» (Россия, г. Новосибирск), остальных пяти изолятов 8-го генотипа ВЛКРС («N006», «N063», «N089», «N121» и «N142») – на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия, г. Москва) с использованием олигонуклеотидов «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных праймеров.
Секвенированные последовательности локуса env-гена выявленных нами изолятов 8-го генотипа ВЛКРС: «N174» (JF713455), «N006» (KC867140), «N063» (KC886616), «N089» (KC886624), «N121» (KC886631), «N142» (KC886634) выравнены по длине 400 нуклеотидов c соответствующими последовательностями типовых представителей известных генотипов BLV, используя программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и MEGA-4, с последующим филогенетическим анализом.
Результаты исследования и их обсуждение
По результатам использования поисковой программы основного локального выравнивания (BLAST), установлено наличие 20 депонированных в GenBank NCBI нуклеотидных последовательностей изолятов нового (8-го) генотипа ВЛКРС.
Перечень этих изолятов BLV с указанием идентификационных номеров доступа (GenBank A/N), начальной даты отправки информации для депонирования в GenBank нуклеотидных последовательностей локуса env-гена провируса, включая регион выявления возбудителя, отражен в табл. 1.
Таблица 1
Перечень изолятов 8-го генотипа ВЛКРС, чьи нуклеотидные последовательности локуса env-гена депонированы в GenBank NCBI
|
№ п/п |
Генотип |
Изолят |
GenBank A/N |
Дата отправки в GenBank |
Регион выявления |
Ссылка |
|
1 |
8-й |
M1/ELG_Cro/08 |
GU724606 |
08-FEB-2010 |
Хорватия |
[4] |
|
2 |
8-й |
4–6 |
HM563764 |
17-JUN-2010 |
Украина |
[11] |
|
3 |
8-й |
4–1 |
HM563766 |
17-JUN-2010 |
Украина |
[11] |
|
4 |
8-й |
3–43 |
HM563767 |
17-JUN-2010 |
Украина |
[11] |
|
5 |
8-й |
2–48 |
HM563768 |
17-JUN-2010 |
Украина |
[11] |
|
6 |
8-й |
N174 |
JF713455 |
19-MAR-2011 |
Россия (Татарстан) |
[1, 2] |
|
7 |
8-й |
ELG_Cro/BEM/08 |
JN990069 |
03-NOV-2011 |
Хорватия |
[4] |
|
8 |
8-й |
ELG_Cro/OSA/08 |
JN990070 |
03-NOV-2011 |
Хорватия |
[4] |
|
9 |
8-й |
ELG_Cro/ORA/09 |
JN990071 |
03-NOV-2011 |
Хорватия |
[4] |
|
10 |
8-й |
ELG_Cro/VRA/09 |
JN990072 |
03-NOV-2011 |
Хорватия |
[4] |
|
11 |
8-ой |
ELG_Cro/MIT/09 |
JN990073 |
03-NOV-2011 |
Хорватия |
[4] |
|
12 |
8-й |
ELG_Cro/BIO/10 |
JN990074 |
03-NOV-2011 |
Хорватия |
[4] |
|
13 |
8-й |
MKC2137 |
JQ675759 |
15-FEB-2012 |
Россия (Московская обл.) |
|
|
14 |
8-й |
MKC3511 |
JQ675760 |
15-FEB-2012 |
Россия (Московская обл.) |
|
|
15 |
8-й |
BLV-Jor-10 |
JX120612 |
24-APR-2012 |
Иордания |
[3] |
|
16 |
8-й |
N006 |
KC867140 |
06-APR-2013 |
Россия (Татарстан) |
Данная статья |
|
17 |
8-й |
N063 |
KC886616 |
10-APR-2013 |
Россия (Татарстан) |
Даннаястатья |
|
18 |
8-й |
N089 |
KC886624 |
11-APR-2013 |
Россия (Татарстан) |
Данная статья |
|
19 |
8-й |
N121 |
KC886631 |
11-APR-2013 |
Россия (Татарстан) |
Данная статья |
|
20 |
8-й |
N142 |
KC886634 |
11-APR-2013 |
Россия (Татарстан) |
Данная статья |
Построенная на основании филогенетического анализа локуса env-гена дендрограмма типовых представителей известных генотипов ВЛКРС представлена на рисунке.
В хронологическом порядке самым первым представителем 8-го генотипа ВЛКРС, депонированным в GenBank NCBI, является изолят «M1/ELG_Cro/08» (GU724606), выявленный в Хорватии. Информация о его генотипической принадлежности, включая еще шесть депонированных хорватскими исследователями изолятов («ELG_Cro/BEM/08», «ELG_Cro/OSA/08», «ELG_Cro/ORA/09», «ELG_Cro/VRA/09», «ELG_Cro/MIT/09», «ELG_Cro/BIO/10») нового генотипа BLV, опубликована в работе D. Balic et al. (2012) [4].
Примечательно, что в том же томе (Vol. 157) журнала Archives of Virology, где публиковались хорватские исследователи [4], но в более позднем его номере (№ 12) вышла статья ученых из Иордании и Саудовской Аравии [3], посвященная детекции и молекулярной характеристике вируса лейкоза крупного рогатого скота, обнаруженного в Иордании. M.M. Ababneh et al. (2012) [3] тогда в своей работе охарактеризовали выявленный ими иорданский изолят «BLV-Jor-10» (JX120612) как принадлежащий новому, ранее не классифицированному генотипу BLV.
Дендрограмма типовых представителей известных генотипов ВЛКРС, построенная на основании филогенетического анализа локуса env-гена [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 62 seq.]. Обозначения: черный круг – изоляты 8-го генотипа BLV, выявленные у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ
Следует отметить, что в вышеперечисленных работах [3, 4] авторы обосновывали существование нового генотипа ВЛКРС только на примере своих выделенных изолятов, без сравнительного анализа с другими представителями ВЛКРС, также входящими в филогенетический кластер данного нового генотипа, среди которых к тому времени уже были депонированные в GenBank NCBI нуклеотидные последовательности локуса env-гена изолятов, выявленных в Украине («3-43», «4-1», «2-48», «4-6») и России («N174»).
В 2013 г. M. Rola-Luszczak et al. [11] в своей статье подтвердили факт существования нового генотипа BLV, проведя филогенетический анализ хорватских, украинских и российского («N174», GenBank A/N: JF713455) изолятов, за исключением иорданского. Также этим коллективом авторов [11] было предложено именовать данный новый генотип BLV «8-ым» генотипом, уточняя при этом, что филогенетическая классификация на основе UPGMA-метода, предложенная ранее японскими исследователями [8] и уже предусматривавшая существование 8-го генотипа возбудителя, является некорректной.
В настоящей же работе представлены результаты расширенного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей локуса env-гена изолятов 8-го генотипа ВЛКРС (рисунок), депонированных в GenBank NCBI на данный момент времени, включая анализ соответствующих последовательностей пяти новых изолятов провируса, обнаруженных нами у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ («N006», «N063», «N089», «N121», «N142»; депонированы в GenBank в 2013 г.), а также двух изолятов BLV («МКС2137» и «МКС3511»; депонированы в GenBank в 2012 г.), выявленных на территории Московской области РФ отечественными учеными из Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко.
Следует подчеркнуть, что все же первое упоминание обоснования факта существования нового 8-го генотипа BLV было изложено в нашей ранней публикации 2011 года [1] с содержащейся в ней информацией, что «...изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входят изученные другими исследователями близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (GenBank A/N: HM563766); «3-41» (GenBank A/N: HM563767]) и Хорватии [«M1/ELG_Cro/08» (GenBank A/N: GU724606)] соответственно» [1].
Заключение
Изоляты нового 8-го генотипа ВЛКРС выявлены в различных регионах мира: Хорватии, Украине, России, Иордании; их нуклеотидные последовательности локуса env-гена депонированы в GenBank NCBI в период с 2010 по 2013 год (GU724606, HM563764, HM563766, HM563767, HM563768, JF713455, JN990069, JN990070, JN990071, JN990072, JN990073, JN990074, JQ675759, JQ675760, JX120612, KC867140, KC886616, KC886624, KC886631, KC886634).
Первая информация об обосновании 8-го генотипа BLV описана в нашей ранней статье 2011 года выпуска [1], с независимым подтверждением факта существования нового (8-го) генотипа ВЛКРС в чуть более поздних публикациях зарубежных и отечественных ученых, вышедших в свет в 2012–2013 годах [3, 4, 11].
Рецензенты:
Госманов Р.Г., д.в.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, г. Казань;
Ахметов Т.М., д.б.н., доцент кафедры технологии животноводства Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, г. Казань.
Работа поступила в редакцию 09.10.2013.