В настоящее время приоритетными являются исследования выхода, состава и свойств пектиновых веществ из нетрадиционного растительного сырья. Одуванчик лекарственный является перспективным сырьем для получения функциональных биологически активных веществ, так как все части этого полезного растения – и корни, и листья, и цветки – имеют целебные свойства [7]. Изучение пектиновых веществ в связи с их ценными физико-химическими свойствами и высокой физиологической активностью [4] позволяет значительно расширить области их практического использования, что является актуальной задачей.
Целью работы являлось выделение пектиновых полисахаридов из корней одуванчика лекарственного Taraxacum оfficinale Wigg. и установление их структуры.
Экспериментальная часть
В работе использовали воздушно-сухие, измельченные до крупности 1–5 мм образцы корней одуванчика лекарственного, собранного в июне до цветения в Иркутском районе.
Для выделения пектиновых полисахаридов использована 2-стадийная обработка корней одуванчика при температурах 25, 70 и 100 °С. На первой стадии образец одуванчика трехкратно экстрагировали свежими порциями дистиллированной воды при указанных температурах. Гидромодуль – 1:10, продолжительность каждой обработки – 2 часа. Водные экстракты объединяли, концентрировали под вакуумом до 1/20 от первоначального объема. Из полученного концентрата обработкой этанолом при комнатной температуре [1] осаждали пектиновые полисахариды (ПС-1). Осадок отделяли фильтрованием, промывали последовательно этанолом, диэтиловым эфиром и сушили при 60 °С до постоянной массы.
На второй стадии твердый остаток после экстракции водой трижды обрабатывали смесью 0,5 %-го водного раствора оксалата аммония и 0,25 %-го водного раствора щавелевой кислоты в соотношении 1:1 (рН = 4) в течение 3 ч при соответствующей температуре и постоянном перемешивании [2]. Экстракт после фильтрования концентрировали до 1/20 от первоначального объема. Из полученного концентрата вышеописанным методом выделяли пектиновые полисахариды (ПС-2).
Кислотный гидролиз полисахаридов осуществляли 2 М раствором трифторуксусной кислоты [2]. Состав гидролизатов определяли на хроматографе 7820 А с селективным масс-спектрометрическим детектором НР 5975 фирмы «Agilent Technologies» [2], количественные спектры ЯМР 13С регистрировали на спектрометре ЯМР фирмы «Bruker» с рабочей частотой 62,8 МГц с шумовой развязкой от протонов и шириной спектров 20–30 кГц после 5000 прохождений. Шумовая развязка выключалась во время релаксационной задержки, которая составляет 10 с, ширина импульса – 90°, параметр уширения линий при экспоненциальном умножении – 10 Гц. Для регистрации спектра использовали раствор пектиновых веществ в D2O. Спектры регистрировали при температуре 25 °С. Расчеты содержания углеводов, функциональных групп и элементного состава по спектру ЯМР осуществляли, используя фрагментный анализ [3], относительная погрешность составляет 7,5 %. Элементный состав определяли на элементном анализаторе Vario micro Cube Elementar.
Результаты исследования и их обсуждение
Корни одуванчика характеризуются относительно высоким содержанием водорастворимых соединений, выход которых повышается с увеличением температуры на первой и на второй стадиях обработки. При 25 °С их выход на первой стадии составил 34,8 %, а при 100 °С – 39,6 % на абсолютно сухую массу корней одуванчика. На второй стадии при 25 °С дополнительно извлечено 11,5 % водорастворимых соединений. При 100 °С суммарный выход водорастворимых соединений достиг 65,6 %.
Повышение температуры обработки корней одуванчика способствует увеличению выхода пектиновых полисахаридов (рисунок). Их суммарный выход при 100 °С составил 18 %, что в 1,5 раза ниже суммарного выхода пектиновых полисахаридов из надземной части одуванчика [7].
Зависимость выхода пектиновых полисахаридов от температуры
Для компонентов фракций полисахаридов, выделенных при 70 °С с близким выходом на первой и второй ступени, характерна относительно высокая насыщенность водородом (табл. 1). С повышением температуры значения (Н/С)ат для фракций снижаются. Независимо от температуры повышенную зольность имеют полисахариды фракции ПС-1.
Таблица 1
Элементный состав пектиновых полисахаридов корней одуванчика*
|
Образец |
Температура, °С |
Элементный состав, в % на орг. массу |
(Н/С)ат |
(О/С)ат |
Зола, в % |
|||
|
С |
Н |
N |
Оd |
|||||
|
ПС-1 |
70 |
41,1 |
7,1 |
1,0 |
50,8 |
2,07 |
0,93 |
5,4 |
|
100 |
42,2 (45,8) |
6,4 (6,5) |
0,7 |
50,7 (47,7) |
1,82 (1,7) |
0,90 (0,78) |
4,9 |
|
|
ПС-2 |
70 |
32,1 |
7,2 |
2,9 |
57,5 |
2,69 |
1,34 |
2,3 |
|
100 |
39,8 (40,6) |
6,6 (6,2) |
3,1 |
50,5 (53,3) |
1,99 (1,8) |
0,95 (0,96) |
3,7 |
|
Примечание.* Значения в скобках рассчитаны по количественным спектрам ЯМР 13С.
Результаты исследования состава гидролизата фракции ПС-1, выделенной при 100 °С, методом ГХ-МС свидетельствуют о том, что в состав исследуемых полисахаридов входят в основном остатки моносахаридов: арабинозы, ксилозы, галактозы, глюкозы и в минорном количестве маннозы (табл. 2). Доминирующим моносахаридом является глюкоза с содержанием более 70 % от суммы моносахаридов. Высокое содержание глюкозы можно объяснить присутствием в составе фракции в качестве основных компонентов глюкана и/или фруктанов, гидролиз которых сопровождается изомеризацией фруктозы в глюкозу. Незначительное содержание в гидролизате остатков галактуроновой кислоты и рамнозы указывает на примесный характер пектиновых полисахаридов во фракции ПС-1.
Таблица 2
Состав гидролизатов полисахаридов* корней одуванчика
|
Образец |
GalA |
Ara |
Xyl |
Man |
Gal |
Glс |
Rha |
|
ПС-1 |
16,4 |
14,9 |
2,3 |
0,3 |
6,7 |
59,3 |
Сл. |
|
ПС-2 |
31,0 |
31,1 |
1,0 |
0,1 |
12,2 |
6,2 |
2,1 |
Примечание.* выделены при 100 °С.
По данным количественной ЯМР 13С, основным углеводом фракции ПС-1 является α-фруктоза – около 90 % масс., положение сигналов атомов углерода которой приведены в табл. 3. Кроме небольших количеств галактуроновой кислоты (фрагменты → 4)-α-D-GalpA-(1→ и →4-α-D-GalpA (1 → 2)) в исследованной фракции присутствуют в малых концентрациях β-фруктоза и α-D-глюкоза.
Качественный состав гидролизата фракции ПС-2 аналогичен, но доминирующими компонентами среди моносахаридов являются арабиноза и галактоза, их соотношение составляет 2,7:1 (табл. 3). Суммарное содержание моносахаридов – около 53 %. Такое содержание остатков арабинозы значительно превышает ее содержание в пектиновых полисахаридах большинства растений, что встречается крайне редко, например, в полисахаридах арганового дерева [8]. Спектр ЯМР 13С фракции ПС-2 корней указывает на присутствие в углеводной цепи пектиновых полисахаридов α-1,4-связанных остатков D-галактопиранозилуроновой кислоты. Выявлен фрагмент → 4)-a-D-GalA-(l→, который дает сигнал аномерного углеродного атома при 100,0 м.д. (табл. 4).
Таблица 3
Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 13С фракции ПС-1 [3, 4, 6, 10, 11]
|
Углеводный остаток |
Химические сдвиги атомов углерода углеводов, м.д. |
|||||
|
С-1 |
С-2 |
С-3 |
С-4 |
С-5 |
С-6 |
|
|
α-Frc |
61,0 |
103,5 |
77,2 |
74,5 |
81,3 |
62,4 |
|
β-Frc |
63,6 |
98,0 |
76,5 |
69,7 |
69,3 |
64,0 |
|
α-D-Glc |
92,7 |
72,6 |
72,8 |
69,9 |
- |
61,4 |
|
→4)-α-D-GalpA-(1→ |
98,3 |
69,3 |
69,7 |
75,5 |
72,8 |
174,9 |
|
→4-α- D-GalpA (1→2) |
98,1 |
69,5 |
69,9 |
77,4 |
72,6 |
174,1 |
Таблица 4
Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 13С пектиновых полисахаридов фракции ПС-2 [3, 4, 6, 10, 11]
|
Углеводный остаток |
Химические сдвиги атомов углерода углеводов, м.д. |
||||||
|
С-1 |
С-2 |
С-3 |
С-4 |
С-5 |
С-6 |
ОСН3 |
|
|
α-L-Araf-(1→3) |
108,4 |
82,2 |
77,6 |
84,4 |
62,1 |
- |
- |
|
→4)-α-D-GalpA-(1→ |
100,0 |
69,0 |
71,9 |
79,1 |
71,8 |
174,3 |
- |
|
100,3 |
69,1 |
69,5 |
78,8 |
71,6 |
176,3 |
- |
|
|
→4-α-GalpA (OMe) |
101,4 |
69,2 |
69,3 |
81,9 |
71,9 |
171,7 |
53,9 |
Положение сигналов остальных атомов углерода остатков D-галактуроновой кислоты соответствует таковому для ЯМР 13С спектров a-1,4-D-галактопиранозилуронана [9]. Присутствие в пектиновых полисахаридах корней одуванчика этерифицированных карбоксильных групп (СООМе) подтверждается соответствующими минорными сигналами 171,7 (СООМе) и 53,9 м.д. (ОСН3), степень метилирования составляет 0,42. Пектиновые полисахариды фракции ПС-2 содержат боковые цепи, образованные с участием α-L-арабинофуранозы. Учитывая незначительное содержание рамнозы в гидролизате, макромолекула полисахарида характеризуется низкой степенью разветвленности. Соотношение углеводных остатков Araf:α-GalA составляет 1:4,3.
Данные ЯМР-спектроскопии подтверждают присутствие в составе исследуемых фракций ПС-1 и ПС-2 остатков нейтральных моносахаридов. Согласно данным табл. 5, наиболее заметно их присутствие во фракции ПС-1. Ацетильные группы обнаружены только во фракции ПС-2.
По методике, описанной в работе [3], с учетом стехиометрических соотношений, данных фрагментного состава (табл. 5) и по элементному составу, полученному по спектрам ЯМР 13С (табл. 1), рассчитано содержание основных углеводов и функциональных групп во фракции ПС-2 (табл. 6).
Таблица 5
Относительное содержание атомов углерода в пектиновых полисахаридах
|
Фрагмент |
Содержание в долях (q) |
Диапазон интегрирования, химические сдвиги (ХС) м.д., отнесение сигналов [3,5-7,10,11] |
|
|
ПС-1 |
ПС-2 |
||
|
С(О)ОН |
0,031 |
0,064 |
177–172; атомы углерода карбоксильных групп |
|
СН3С(О)О |
0,000 |
0,008 |
175,4; атомы углерода ацетильных групп* |
|
С(О)ОСН3 |
0,021 |
0,047 |
172–170; атомы углерода сложноэфирных групп |
|
С-1 |
0,156 |
0,142 |
105–95; аномерные атомы углерода углеводов |
|
СН–ОН |
0,384 |
0,569 |
85–66; атомы С-2, С-3, С-4, С-5 углеводов |
|
СН2–ОН |
0,256 |
0,027 |
64–58; атомы углерода С-6 углеводных колец |
|
–ОСН3 |
0,21 |
0,040 |
62–61; 52–54; атомы углерода метоксильных групп |
|
–СН3 |
0,000 |
0008 |
22–19; атомы углерода метильных групп ацетильного фрагмента |
|
–СН2 –СН3 |
0,000 |
0,032 |
58,4 и 18,2 узкие резонансные сигналы СН2 и СН3– групп этилового спирта С2Н5ОН |
Примечание.*в спектре ЯМР 1Н образца ПС-1 наблюдаются сигналы атомов водорода фрагмента СН3 ацетильных групп с ХС 1,93 и 2,3 м.д.
Таблица 6
Содержание функциональных групп и углеводных остатков во фракции ПС-2, в % масс
|
Образец |
Углеводы |
Функциональные группы |
||||
|
α-GalAp |
α-L-Аraf |
С(О)ОН |
С(О)ОCH3 |
CH3C(O)O |
OCH3 |
|
|
ПС-2 |
41,9 |
13,4 |
10,2 |
9,82 |
15,9 |
5,2 |
По данным ЯМР 13С содержание галактуроновой кислоты во фракции ПС-2 примерно на 11 % выше в сравнение с результатами анализа методом ГХ-МС. Около 42 % карбоксильных групп галактуроновой кислоты этерифицировано.
Заключение
В результате проведенного исследования из корней одуванчика выделены две фракции полисахаридов, одна из которых (ПС-2) с выходом 9,4 % может быть отнесена к пектиновым полисахаридам с содержанием остатков α-1,4-связанной D-галактопиронозилуроновой кислоты 41,9 % масс. Для протопектина корней одуванчика характерна относительно низкая разветвленность основной углеводной цепи. В ее составе обнаружены боковые цепи, образованные с участием α-L-арабинофуранозы, а также остатки глюкозы, ксилозы и галактозы. Основными компонентами фракции ПС-1 являются фруктаны (и/или глюкан). Пектиновые полисахариды присутствуют во фракции в виде примеси, содержание остатков галактуроновой кислоты не превышает 16,4 % масс.
Рецензенты:
Дьячкова С.Г., д.х.н., профессор, заведующая кафедрой химической технологии, декан химико-металлургического факультета, ФБГОУ ВПО «Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет», г. Иркутск;
Пожидаев Ю.Н., д.х.н., профессор кафедры химии и пищевой технологии, ФБГОУ ВПО «Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет», г. Иркутск.
Работа поступила в редакцию 20.09.2013.