Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Основная протективная роль в иммунном ответе при туберкулезной инфекции принадлежит специфическому клеточно-опосредованному иммунному ответу, главным компонентом которого выступают T-хелперы типа 1 (Th1). Данному типу лимфоцитов отводится особая значимость в аспекте туберкулеза легких (ТЛ) за их способность секретировать интерферон (IFN) γ, с которым связывают развитие широкого спектра механизмов антимикобактериальной защиты [2]. Данный цитокин вырабатывается активированными Т-клетками и является мощным фактором активации макрофагов, их метаболизма и бактерицидной функции, оказывая в целом стимулирующее влияние на формирование клеточного иммунитета [1, 4].

Цель исследования – оценить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и уровень секреции ими IFN-γ при лекарственно-устойчивом инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких.

Материал и методы исследования

Обследовано 46 пациентов (37 мужчин и 9 женщин в возрасте 20–55 лет) с впервые выявленным лекарственно-устойчивым (ЛУ) ТЛ, которые в зависимости от клинической формы заболевания были разделены на группы с инфильтративным ТЛ (22 пациента) и с диссеминированным ТЛ (24 пациента). Группу сравнения составили 35 здоровых доноров с аналогичными возрастно-половыми характеристиками. Материалом для исследования служили лимфоциты венозной крови больных ТЛ и здоровых доноров. Выделение мононуклеарных лейкоцитов осуществляли методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см3). Для выделения лимфоцитов из культуры мононуклерных клеток использовали метод адгезии к пластику.

В качестве специфических индукторов лимфоцитов использовались рекомбинантные цитокины IL-12 и IL-27 (eBioscience Company, США; в дозе 20 и 10 нг/мл соответственно). Для определения внутриклеточного IFN-γ культивирование лимфоцитов проводили в полной питательной среде в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в течение 8 ч с поэтапным добавлением индукторов и блокатора внутриклеточного транспорта монензина («Sigma», США; в дозе 5 мкг/мл). Для исследования секреции IFN-γ лимфоциты инкубировали в полной питательной среде в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в течение 48 ч (без и в присутствии индукторов) соответственно.

Процедура определения поверхностных молекул CD3 и внутриклеточного IFN-γ включала в себя Fc-блокировку клеток, фиксацию, пермеабилизацию и окрашивание специфическими моноклональными антителами. Исследование осуществляли методом двухцветной цитометрии на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием изотипических контролей («R&D Systems», США).

Уровень базальной и IL-12/IL-27-индуцированной секреции IFN-γ оценивали в супернатантах культуральных суспензий лимфоцитов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), согласно рекомендациям фирмы-производителя («Cusabio Biotech», США).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартных алгоритмов биометрии.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование секреции IFN-γ лимфоцитами крови in vitro выявило высокий базальный ее уровень у больных ТЛ вне зависимости от клинической формы заболевания по сравнению с показателями у здоровых добровольцев (табл. 1). IL-12/IL-27-индукция лимфоцитов in vitro приводила к увеличению секреции IFN-γ как при инфильтративном ТЛ (в 2,1 раза, p3 < 0,001), так и при диссеминированном ТЛ (в 3,0 раза, p3 < 0,001) по отношению к базальному ее уровню, а также по сравнению с величиной аналогичного показателя в группе контроля (в 3,1 и 4,7 раза соответственно, p1 < 0,001). При этом диссеминированный ТЛ характеризовался максимальной величиной индуцированной секреции изучаемого цитокина (табл. 1).

На фоне описанных изменений продукции IFN-γ in vitro у больных ЛУТЛ в случае диссеминированной формы заболевания регистрировалось увеличение относительного количества всех IFN-γ-позитивных лимфоцитов (р1 < 0,001). При инфильтративной форме ЛУТЛ изменений в численности IFN-γ+ клеток не отмечалось. В то же время как при инфильтративном, так и при диссеминированном ЛУТЛ фиксировалась Т-лимфоцитопения (снижение относительного и абсолютного числа CD3+ клеток), наиболее выраженная у пациентов с диссеминированной формой заболевания (р1 < 0,001).

Таблица 1

Секреция IFN-γ лимфоцитами крови in vitro у больных лекарственно-устойчивым туберкулезом легких, Ме (Q1-Q3)

Примечание. Здесь и в табл. 2: р1 – уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых добровольцев; р2 – по сравнению с показателями у больных с инфильтративным туберкулезом легких; р3 – по сравнению с показателями базальной секреции цитокина.

В ходе исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови (табл. 2) у больных ЛУТЛ независимо от клинической формы заболевания было выявлено уменьшение относительного количества CD3+IFN-γ+ лимфоцитов по сравнению с показателем в группе контроля (р1 < 0,001). При этом в обеих группах больных ТЛ регистрировалось увеличение процентного числа CD3-IFN-γ+ лимфоцитов относительно нормальных значений (р1 < 0,001), наиболее выраженное при диссеминированной форме ЛУТЛ (табл. 2). Кроме того, у пациентов с диссеминированным ЛУТЛ в отличие от показателей у здоровых добровольцев и больных с инфильтративной формой заболевания отмечалось снижение численности CD3+IFN-γ- лимфоцитов (р1 < 0,001, р2 < 0,001) на фоне повышенного содержания CD3-IFN-γ- клеток (р1 < 0,001, р2 < 0,001) (табл. 2).

Таким образом, ЛУТЛ характеризуется гиперсекрецией IFN-γ in vitro, снижением числа CD3+IFN-γ+ лимфоцитов и увеличением доли IFN-γ-позитивных клеток, не несущих на своей поверхности CD3-маркер, на фоне общей Т-лимфоцитопении. Наиболее ярко данные изменения представлены при диссеминированной форме заболевания и дополняются снижением количества CD3+IFN-γ- (чем объясняется большая выраженность Т-лимфоцитопении при данной форме заболевания), а также увеличением доли CD3-IFN-γ- клеток.

В целом обнаруженная при ТЛ гиперпродукция IFN-γ подтверждается данными литературы [5]. Однако, принимая во внимание зарегистрированное в настоящем исследовании снижение числа CD3+IFN-γ+ лимфоцитов на фоне гиперпродукции IFN-γ in vitro, можно предположить существенный вклад в секрецию цитокина лимфоцитов, не несущих на своей поверхности CD3-маркер, в частности, натуральных киллеров (NK), увеличение численности и усиление IFN-γ-продуцирующей активности которых выявлено при ТЛ [1, 5, 7]. Данные клетки могут входить в пул CD3-IFN-γ+ лимфоцитов, повышенное содержание которых было установлено в настоящем исследовании.

Таблица 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных лекарственно-устойчивым туберкулезом легких, Ме (Q1-Q3)

Тем не менее, говоря об инфильтративном ТЛ, важно отметить, что он является классическим примером заболевания, иммунный ответ при котором протекает по Th1-зависимому пути [5]. Диссеминированный ТЛ, в свою очередь, является примером ареактивного течения инфекционного процесса с формированием патологической «иммунной девиации» в направлении Th2-зависимого ответа. Бактериемия, являющаяся обязательным фактором развития данной клинической формы ТЛ, способствует запуску Th2-иммунного ответа и активации различных Th1-иммуносупрессорных факторов [3, 6]. Так, показано, что течение диссеминированного ТЛ сопровождается увеличением в крови численности Т-регуляторных клеток (Treg), опосредующих свой супрессорный эффект посредством экспрессии ингибиторных молекул (CTLA-4) и секреции иммуноцитокинов (интерлейкина (IL) 10, трансформирующего фактора роста (TGF) β и др.) [9]. Кроме того, в последнее время появилась информация о IFN-γ-продуцирующей способности Treg [2, 6, 10]. Однако секретированный ими IFN-γ, как предполагается, является ингибитором активации Th1-лимфоцитов, угнетает пролиферацию и дифференцировку наивных Т-клеток и индуцирует их преждевременную гибель путем апоптоза [2, 10, 11]. Наибольшая выраженность установленных изменений при диссеминированном ЛУТЛ, в частности, более значимые (относительно показателей при инфильтративной форме ЛУТЛ) уровень секреции IFN-γ in vitro и Т-лимфоцитопения, позволяет предположить вклад в IFN-γ-продукцию при данной форме заболевания не только NK-клеток, но и Treg. Кроме того, в настоящее время активно изучаются натуральные киллерные Т-клетки (NKT), способные секретировать IFN-γ, численность которых также увеличивается при туберкулезной инфекции [7, 8].

Вместе с тем, рассуждая о вкладе Treg и NKT-клеток в гиперсекрецию IFN-γ при ТЛ, необходимо отметить, что они, как и Th1-лимфоциты, имеют CD3+-иммунофенотип. Следовательно, мы лишь условно можем говорить о перераспределении в субпопуляционном составе Т-клеток, сопровождающемся снижением количества и активности Th1-лимфоцитов на фоне увеличения содержания и функциональной активности Treg и NKT-клеток.

Заключение

Лекарственно-устойчивый туберкулез легких сопровождается усилением базальной и IL-12/IL-27-индуцированной секреции IFN-γ лимфоцитами крови in vitro с максимальной выраженностью изменений при диссеминированной форме заболевания. Гиперсекреция IFN-γ in vitro сопряжена с низким содержанием CD3+IFN-γ+ лимфоцитов и увеличением доли CD3-IFN-γ+ на фоне общей Т-лимфоцитопении.

Рецензенты:

Воронкова О.В., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск;

Наследникова И.О., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск.