В настоящее время происходит стремительное сокращение ареалов распространения и полное исчезновение редких видов растений. В связи с этим возникла необходимость разработки методов воспроизведения, сохранения и поддержания биологического разнообразия [1] путем использования методов биотехнологии для воспроизведения редких растений [2].
К редким растениям, нуждающимся в охране и репродукции, в Дагестане относится катран бугорчатый (Crambe giberosa) со второй категорией редкости [3]. Это многолетний, травянистый, степной гемикриптофит, обитающий в сухих степях, на каменистых склонах. Лимитирующими факторами для вида является малочисленность популяции из-за выпаса скота, хозяйственного освоения местности. Он занесен в Красную книгу Ставропольского края (2002). В условиях ex situ испытывается в Горном ботаническом саду ДНЦ РАН. Необходимо выявление состояния популяций для создания специализированного ООПТ.
Целью работы была разработка методики выведения in vitro катрана бугорчатого и оценка стрессоустойчивости с использованием методов биотехнологии.
Материалы и методы исследования
Исходным материалом для введения в культуру in vitro катрана бугорчатого служили семена и зеленые побеги с растений ценопопуляции Талгинского ущелья, предоставленные сотрудниками кафедры ботаники ДГУ. Стерилизацию зеленых побегов проводили в несколько этапов. Предварительно побеги замачивали в мыльной воде с добавлением 2–3 капель твин-80 в течение 10–15 минут, почистив их, несколько раз промывали водопроводной и 2–3 раза – дистиллированной водой. Перед стерилизацией в течение 8 минут в 0,1 %-м растворе сулемы (HgCl2) зеленые побеги разрезали на небольшие части и парафинировали срезы для предотвращения попадания в ткани стерилизующего агента. После стерилизации экспланты побегов промывали в дистиллированной воде поочередно в течение 5, 10 и 15 минут. Узловые экспланты помещали на питательную среду Мурасиге – Скуга (МС). Асептику обеспечивали по общепринятой методике в условиях ламинар-бокса [4, 5].
Семена катрана бугорчатого вводили в культуру in vitro двумя способами. В первом случае их перед стерилизацией очищали только от скорлупы (перикарп), а во втором – очищали не только от скорлупы, но и от семенной кожицы. Для стерилизации семена помещали в 70 % спирт на 1 минуту, после на 10 минут – в 3 % перекись водорода.
Культивирование узловых эксплантов и семян проводили в условиях 16-часового фотопериода, при температуре 23–25 °С на среде Мурасиге‒Скуга (МС) с добавлением регуляторов роста ИМК и БАП, соли NaCl разных концентрации и полиэтиленгликоля (ПЭГ). Для предотвращения грибковой инфекции в среду добавляли флуконазол (50 мг/50 мл на 100 мл среды 0,5 мл раствора) [6].
Жизнеспособность эксплантов оценивали по показателям выживаемости (% выживших от общего числа эксплантов в варианте), каллусо- и корнеобразованию, визуально по мощности развития каллуса (начало закладки – 1 балл, слабое покрытие каллусом раневой поверхности – 2 балла, мощное ее покрытие – 3 балла.
Результаты исследования и их обсуждения
Экспланты зеленых побегов катрана бугорчатого характеризовались очень низкой жизнеспособностью по сравнению с семенами, отличающимися высокой всхожестью и хорошим ростом. Культивировали узловые экспланты зеленых побегов на среде МС с добавлением ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л). Повторность опыта двукратная.
На 5–7 сутки культивирования все экспланты стали коричневыми. Прорастание у семян в варианте 2 (без покровов) наблюдалось на 6–7 сутки культивирования. На 30 сутки из всех культивированных семян (100 %) формировались полноценные проростки с хорошо развитым побегом и корневой системой. У семян в варианте 1 (с семенной кожицей) не обнаружен рост даже на 90 сутки (табл. 1). Поэтому все основные исследования в дальнейшем проводились на семенах с очищенной семенной кожицей.
Таблица 1
Жизнеспособность семян катрана при культивировании на среде МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) без очистки (А) и с очисткой (Б) семенной кожицы
|
Семена |
Сутки |
Прорастание, % |
Рост |
Морфогенез, % |
|||
|
% |
балл |
корни |
почки |
побеги |
|||
|
А |
90 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Б |
30 |
100 |
100 |
3 |
100 |
100 |
100 |
Изучение влияния регуляторов роста на прорастание семян проводилось по четырем вариантам на питательной среде МС (табл. 2).
Таблица 2
Влияние гормонального состава питательной среды МС на прорастания семян катрана бугорчатого
|
Варианты |
Прорастание |
Рост |
Морфогенез, % |
|||
|
сутки |
% |
% |
балл |
корни |
побеги |
|
|
1 |
7 |
100 |
100 |
3 |
100 |
100 |
|
2 |
10 |
100 |
100 |
3 |
100 |
100 |
|
3 |
10 |
75 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
4 |
10 |
88 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Примечание. Варианты культивирования: среда МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) (1); МС + БАП (0,5 мг/л) (2); МС (3); МС + ИМК (0,5 мг/л) (4)
Изучено влияние NaCl (0,5 и 1 %) и ПЭГ (5 %) на прорастание семян катрана бугорчатого (табл. 3). На 14 сутки по всем вариантам отмечено прорастание семян. Однако следует отметить, что варианты отличались реализации регенерационного потенциала и морфогенеза. Так, на 14 сутки у проросших семян ризогенез наблюдался только в контрольном варианте (100 %) и в варианте с NaCl 0,5 % (60 %), а в варианте с ПЭГ 5 %, где так же, как и в других вариантах наблюдалось прорастание семян, но без закладки корней даже на 60 сутки.
Уже на 60 сутки культивирования было четко видно количество проросших семян и процессы их морфогенеза (ризогенез, закладка почек и побегообразование) в зависимости от варианта среды. В контроле на 60 сутки у всех проросших семян отмечены закладка почек и побегообразование, тогда как у семян варианта с NaCl (0,5 %) – у 80 %, а варианта с ПЭГ (5 %) – только у 30 %.
Таблица 3
Жизнеспособность семян катрана бугорчатого на 14(а) и 60 (б) сутки их культивирования
|
Варианты |
Сроки прорастания, сутки |
Прорастание, % |
Рост |
Морфогенез, % |
|||
|
% |
балл |
корни |
почки |
побеги |
|||
|
1 |
а |
100 |
100 |
3 |
100 |
0 |
100 |
|
б |
100 |
100 |
3 |
100 |
100 |
100 |
|
|
2 |
а |
80 |
80 |
2,5 |
60 |
0 |
80 |
|
б |
80 |
80 |
2,5 |
80 |
80 |
80 |
|
|
3 |
а |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
б |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
4 |
а |
60 |
60 |
2 |
0 |
0 |
30 |
|
б |
60 |
60 |
2 |
0 |
30 |
30 |
|
Примечание. Варианты культивирования: среда МС + ИМК и БАП – контроль (1); МС + ИМК и БАП + NaCl 0,5 % (2); МС + ИМК и БАП + NaCl 1 % (3); МС + ИМК и БАП + ПЭГ (5 %) (4)
Также изучена жизнеспособность узловых и листовых эксплантов катрана бугорчатого на среде МС с добавлением разных концентраций ИМК, БАП, NaCl и ПЭГ (табл. 4). Так, на 10 сутки культивирования у узловых и листовых эксплантов в контроле выживаемость составила 100 %, у всех эксплантов наблюдался интенсивный рост (100 %). Процессы морфогенеза (закладка почек и побегообразование) происходили только на узловых эксплантах (100 %), а каллуссогенез отсутствовал как на листовых, так и на узловых эксплантах. Устойчивость узловых и листовых эксплантов к действию NaCl (0,5 и 1 %) и ПЭГ – (5 %) оценивали добавлением их в питательную среду МС. Узловые и листовые экспланты на 10 сутки в варианте МС с NaCl (0.5 %) сохранили зеленую окраску и высокую жизнеспособность. Однако процессы роста, каллусогенеза и морфогенеза отсутствовали, а на 60 сутки наблюдалась гибель (100 %) как узловых, так и листовых эксплантов.
Таблица 4
Жизнеспособность узловых (а), листовых (б) и корневых (в) эксплантов катрана бугорчатого
|
Вариант среды |
Экспланты |
Сроки культивирования, сутки |
Выживаемость, % |
Рост |
Морфогенез, % |
|||
|
% |
балл |
корни |
почки |
побеги |
||||
|
I |
а |
10 |
100 |
100 |
3 |
0 |
100 |
100 |
|
б |
10 |
100 |
100 |
3 |
0 |
0 |
0 |
|
|
II |
а |
10 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
60 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||
|
б |
10 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
60 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||
|
III |
а |
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
б |
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
IV |
а |
10 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
60 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||
|
б |
10 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
60 |
20 |
0 |
0 |
0 |
0 |
-0 |
||
|
V |
а |
30 |
100 |
100 |
3 |
0 |
100 |
100 |
|
б |
30 |
100 |
100 |
3 |
0 |
0 |
0 |
|
|
VI |
а |
20 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
б |
20 |
60 |
100 |
2,5 |
0 |
0 |
0 |
|
|
в |
25 |
30 |
0 |
0 |
0 |
100 |
100 |
|
Примечание. Узловые и листовые экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого на среде МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) (Iа,б); МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + NaCl (0,5 %) (IIа, б), МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + NaCl (1 %) (III а, б), МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + ПЭГ (5 %) (IV а,б), МС + БАП (0,5 мг/л) (Vа, б). МС + БАП (0,5 мг/л) (VI а, б, в).
На среде МС с NaCl 1 % уже на 10 сутки отмечалась 100 %-я гибель узловых и листовых эксплантов. Они в варианте с ПЭГ (5 %), характеризовались 100 % -й выживаемостью без ростовых процессов. На 60 сутки отмечен отмирание узловых эксплантов, тогда как выживаемость листовых составила 20 %. Листовые экспланты и на 60 сутки сохранили зеленую окраску, хотя нередко отмечались почернение и высыхание листовой пластинки (рис. 1). Несмотря на слабую выживаемость листовых эксплантов (в отличие от узловых) на среде МС с ПЭГ (5 %), у них не наблюдался рост, закладка каллуса, почек и корней.
Наряду с изучением воздействия NaCl и ПЭГ на узловые и листовые экспланты катрана бугорчатого было исследовано влияние на них БАП (0.5 и 5 мг/л). И узловые, и листовые экспланты на среде МС с БАП (0,5 мг/л) на 30 сутки характеризовались высокой выживаемостью и ростом (100 %). Однако у узловых эксплантов наблюдалась закладка почек и рост побегов (100 %). На среде МС с БАП (5 мг/л) на 20 сутки культивирования узловые экспланты отмерли, тогда как выживаемость листовых составила 60 %. Они характеризовались высокими показателями роста (100 %) без морфогенеза (рис. 2, а). Листовые хотя и имели зеленую окраску, отмечались некрозы на раневой поверхности (рис. 2, б). На 25 сутки культивирования у корневых эксплантов на среде МС с цитокининами в концентрации 5 мг/л наблюдали закладку адвентивных почек и рост побегов (рис. 3).
а 
б 
в 
Рис. 1. Листовые экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого, проросших из семян, при посадке (а) на 10 (б), 60 (в) сутки культивирования на среде МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + ПЭГ 5 %
а 
б 
в 
Рис. 2. Листовые (а, б, в) экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого, проросших из семян на 20 сутки на среде МС + БАП (5 мг/л)
Выводы
Высокая всхожесть семян (100 %) у Crambe giberosa достигается скарификацией, что свидетельствует о покое при сопротивлении покровов семени. Его снятие ведет к повышению всхожести семян.
Рис. 3. Корневые экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого на 25 стуки на среде МС + БАП (5 мг/л)
Выявлена зависимость прорастания семян от наличия в среде регуляторов роста ИМК и БАП. В среде с содержанием гормонов прорастание наблюдалось у 100 % культивированных семян, а без них – у 25 %.
Изучено действие NaCl (0,5; 1 %) и ПЭГ (5 %) на прорастание семян, морфогенез узловых и листовых эксплантов. Концентрация NaCl (1 %) полностью подавляет всхожесть семян катрана бугорчатого, а вариант 0,5 % характеризовался процессами роста и морфогенеза у прорастающих семян. ПЭГ 5 % подавлял ризогенез, побегообразование и закладку почек у прорастающих семен. У узловых и листовых NaCl (0,5; 1 %) подавляет морфогенез и приводит к их отмиранию. ПЭГ (5 %), как и NaCl (0,5; 1 %), губительно действует на узловые и листовые экспланты катрана бугорчатого. Узловые экспланты характеризуются отмиранием, а выживаемость листовых эксплантов составила 20 % без роста и морфогенеза.
Действие БАП (0,5 и 5 мг/л) на узловые, листовые и корневые экспланты катрана бугорчатого характеризовалось 100 %-й выживаемостью и ростом (0,5 мг/л). Однако у узловых эксплантов в отличие от листовых наблюдалась закладка почек и рост побегов (100 %). БАП (5 мг/л) губителен для узловых эксплантов, но стимулирует рост листовых эксплантов и характеризуется частичным некрозом раневой поверхности. У корневых эксплантов наблюдалась закладка почек и рост побегов.
Итак, разработана методика in vitro тканей катрана бугорчатого и оценка устойчивости к стрессам, определен гормональный состав питательной среды для роста и морфогенеза у эксплантов побегов и семян катрана бугорчатого.
Рецензенты:
Абдулмалик Г.Ю., д.б.н., профессор кафедры физиологии растений и теории эволюции биологического факультета Дагестанского государственного университета, г. Махачкала;
Куркиев К.У., д.б.н., профессор кафедры ботаники, генетики и селекции Дагестанского государственного аграрного университета, г. Махачкала.
Работа поступила в редакцию 01.08.2013.