В связи с широким распространением инфекционных заболеваний, вызванных устойчивыми к антибактериальным средствам возбудителями, исследования, посвященные причинам развития и методам преодоления антибиотикорезистентности, являются актуальными.
Фторхинолоны обладают широким спектром антибактериальной активности [5]. Одной из привлекательных особенностей этого класса антибактериальных веществ является их способность оказывать быстрое бактерицидное действие, выраженность которого может сильно отличаться между различными производными. Ципрофлоксацин – один из наиболее эффективных фторхинолонов, нашедший широкое применение в клинической практике, что отразилось, в частности, в большом количестве наименований, под которыми он выпускается в разных странах [3].
Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка влияния некоторых антиоксидантов (восстановленный глутатион, N-ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол) на чувствительность штаммов кишечной палочки к ципрофлоксацину.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на трех штаммах Escherichia coli, депонированных на кафедре микробиологии с вирусологией Алтайского государственного медицинского университета: контрольный штамм ATCC 25922 (далее – штамм № 1); штамм, полученный из цервикального канала больной 22 лет, страдающей хроническим эндометритом (далее – штамм № 2); штамм, полученный из кала пациента 62 лет с диагнозом «дисбактериоз» (далее – штамм № 3). Идентификация микроорганизмов проводилась при помощи системы «ENTEROtest 16» (Erba Lachema s.r.o., Чехия) с использованием планшетного фотометра Multiskan-Ascent (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия) и программного обеспечения «Микроб-Автомат». Из указанных штаммов готовили суточные культуры инкубацией на скошенном агаре при 35 °С, которые использовали для приготовления инокулятов – бактериальных суспензий в 0,9 % растворе хлорида натрия с оптической плотностью 1,0 по Мак-Фарланду. Перед инокуляцией методом разведения определяли минимальную подавляющую концентрацию ципрофлоксацина (МПК).
Для инкубации готовили смесь на основе минеральной питательной среды M9. В среду добавлялись изучаемые антиоксиданты (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мМ, а также ципрофлоксацин до сублетальной концентрации, составляющей 50 % ранее определенной МПК для каждого штамма в заданных условиях инкубации (приведены в табл. 1).
После инокуляции бактериальной суспензии смесь инкубировали в воздушном термостате при 35 °С в течение 24 часов. Для оценки развития штаммов использовали аппарат для определения оптической плотности бактериальных взвесей Densi-la-meter (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Полученные данные сравнивали с данными контрольных инкубационных смесей, не содержащих антиоксиданты. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметического критерия Манна‒Уитни с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США), различия считали значимыми при P < 0,05 (в таблицах уровень статистической значимости указан в верхнем индексе после значения) [1].
Результаты исследования и их обсуждение
Введение в инкубационную среду сублетальных концентраций ципрофлоксацина, составляющих 50 % МПК для каждого из изучаемых штаммов, вызывает стойкое сдерживание роста бактериальных культур с нерезким увеличением оптической плотности на протяжении суток (табл. 1). Медленное увеличение бактериальной биомассы, по-видимому, обусловлено приобретением частичной резистентности к ципрофлоксацину отдельных бактериальных клеток.
Таблица 1
Влияние сублетальных концентраций ципрофлоксацина на развитие периодических культур Escherichia coli
|
Штамм |
СЦИП, мг/л |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду* |
|||
|
4 ч |
8 ч |
12 ч |
24 ч |
||
|
№ 1 |
0 |
0,3(0,3;0,3) |
2,6(2,5;2,6) |
4,2(4,1;4,2) |
4,2(4,1;4,2) |
|
0,035 |
0,2(0,2;0,2)0,002 |
0,2(0,2;0,2)0,001 |
0,3(0,3;0,4)0,002 |
0,6(0,4;0,7)0,002 |
|
|
№ 2 |
0 |
0,7(0,7;0,7) |
4,1(4,0;4,2) |
4,7(4,7;4,7) |
4,3(4,3;4,4) |
|
0,02 |
0,2(0,2;0,3)0,002 |
0,3(0,3;0,4)0,001 |
0,4(0,3;0,4)0,002 |
0,9(0,7;1,0)0,003 |
|
|
№ 3 |
0 |
0,6(0,6;0,7) |
4,4(4,4;4,6) |
4,7(4,7;4,8) |
4,1(4,0;4,2) |
|
0,04 |
0,4(0,4;0,5)0,002 |
0,7(0,7;0,8)0,002 |
0,8(0,7;0,8)0,002 |
0,8(0,7;0,8)0,002 |
|
Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры без ципрофлоксацина.
Аскорбиновая кислота не вызывает каких-либо закономерных изменений активности ципрофлоксацина в первые 8 часов эксперимента (табл. 2). При измерении оптической плотности бактериальной биомассы на 12 и 24 час становится заметным потенцирующее влияние антиоксиданта в наиболее высоких изучаемых концентрациях на действие антибактериального средства.
Более выраженно изменяет активность ципрофлоксацина восстановленный глутатион, пробактериальное действие которого становится заметным уже через 4 часа после начала инкубации (табл. 3). Исходя из суточного профиля развития бактериальных культур, можно сделать вывод о том, что указанный антиоксидант значительно уменьшает бактерицидное действие ципрофлоксацина (после инкубации в течение суток оптическая плотность инкубационных смесей при наиболее высоких концентрациях антиоксиданта превышает контрольные значения в 2–3 раза).
В связи с вышеописанными эффектами восстановленного глутатиона определенный интерес представляет собой соответствующий профиль влияния еще одного антиоксиданта, содержащего тиольную группу – N-ацетилцистеина. При сопоставлении данных табл. 3 и 4 становится очевидным сходное влияние двух антиоксидантов, проявляющееся как в факте самого пробактериального действия, так и в степени ответа каждой из изучаемых периодических культур на присутствие восстановленного глутатиона и N-ацетилцистеина. Отметим, что ранее нами были описаны неоднозначные эффекты антиоксидантов на развитие Escherichia coli: восстановленный глутатион в концентрациях 0,25–0,5 мМ стимулирует развитие бактерий, в концентрациях 2 и 4 мМ ‒ оказывает слабое угнетающее действие; N-ацетилцистеин во всех концентрациях снижает интенсивность развития бактериальных культур в отсутствии антибактериальных средств [2].
Таблица 2
Влияние аскорбиновой кислоты на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli
|
САО, мМ |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду* |
||||
|
4 ч |
8 ч |
12 ч |
24 ч |
||
|
Штамм № 1 |
0,25 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,350 |
0,2(0,2;0,3)0,044 |
0,6(0,4;0,6)0,340 |
|
0,5 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,178 |
0,2(0,2;0,3)0,473 |
0,3(0,2;0,3)0,110 |
0,5(0,4;0,5)0,280 |
|
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,350 |
0,3(0,2;0,3)0,004 |
0,4(0,4;0,5)0,174 |
|
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,350 |
0,2(0,2;0,3)0,044 |
0,3(0,3;0,3)0,010 |
|
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,350 |
0,2(0,2;0,2)0,004 |
0,3(0,3;0,4)0,009 |
|
|
Штамм № 2 |
0,25 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,501 |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
0,4(0,4;0,4)0,240 |
0,8(0,7;1,0)0,805 |
|
0,5 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,501 |
0,3(0,3;0,3)0,417 |
0,4(0,2;0,4)0,840 |
0,8(0,5;0,9)0,497 |
|
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,501 |
0,3(0,3;0,4)0,765 |
0,4(0,4;0,4)0,477 |
0,7(0,7;0,9)0,387 |
|
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,501 |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
0,4(0,3;0,4)0,621 |
0,6(0,6;0,8)0,155 |
|
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,130 |
0,2(0,2;0,3)0,015 |
0,3(0,3;0,3)0,019 |
0,6(0,6;0,7)0,108 |
|
|
Штамм № 3 |
0,25 мМ |
0,4(0,3;0,4)0,225 |
0,7(0,6;0,8)0,741 |
0,8(0,8;0,8)0,501 |
0,7(0,7;0,7)0,025 |
|
0,5 мМ |
0,4(0,3;0,4)0,225 |
0,7(0,7;0,7)0,624 |
0,8(0,7;0,8)0,943 |
0,7(0,7;0,7)0,040 |
|
|
1 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,7(0,7;0,8)0,621 |
0,7(0,7;0,7)0,179 |
0,7(0,7;0,7)0,168 |
|
|
2 мМ |
0,4(0,3;0,4)0,225 |
0,7(0,7;0,7)0,240 |
0,8(0,7;0,8)0,943 |
0,7(0,7;0,7)0,025 |
|
|
4 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,6(0,6;0,7)0,167 |
0,7(0,7;0,7)0,179 |
0,6(0,6;0,7)0,008 |
|
Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).
Таблица 3
Влияние восстановленного глутатиона на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli
|
САО, мМ |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду* |
||||
|
4 ч |
8 ч |
12 ч |
24 ч |
||
|
Штамм № 1 |
0,25 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,678 |
0,2(0,2;0,3)0,473 |
0,3(0,3;0,3)0,942 |
1,3(1,1;1,6)0,009 |
|
0,5 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,678 |
0,3(0,2;0,3)0,155 |
0,3(0,3;0,3)0,479 |
1,3(1,0;1,7)0,026 |
|
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,678 |
0,2(0,2;0,2)0,930 |
0,3(0,3;0,3)0,578 |
1,1(1,0;1,6)0,018 |
|
|
2 мМ |
0,3(0,2;0,3)0,056 |
0,3(0,3;0,3)0,028 |
0,3(0,3;0,4)0,727 |
1,6(1,5;1,7)0,002 |
|
|
4 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,011 |
0,3(0,3;0,3)0,006 |
0,4(0,4;0,4)0,114 |
2,0(1,2;2,3)0,015 |
|
|
Штамм № 2 |
0,25 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,179 |
0,3(0,3;0,4)0,765 |
0,4(0,4;0,4)0,477 |
0,9(0,8;1,0)0,803 |
|
0,5 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,037 |
0,4(0,4;0,4)0,016 |
0,4(0,4;0,5)0,109 |
0,9(0,9;1,1)0,536 |
|
|
1 мМ |
0,3(0,3;0,4)0,013 |
0,5(0,5;0,5)0,001 |
0,6(0,6;0,7)0,002 |
1,1(1,0;1,2)0,072 |
|
|
2 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,003 |
0,6(0,6;0,6)0,001 |
0,7(0,5;0,7)0,065 |
1,2(1,1;1,2)0,040 |
|
|
4 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,001 |
0,6(0,6;0,6)0,001 |
0,8(0,8;0,8)0,002 |
1,3(1,3;1,4)0,007 |
|
|
Штамм № 3 |
0,25 мМ |
0,4(0,4;0,5)0,497 |
0,8(0,8;0,9)0,009 |
0,8(0,8;0,8)0,065 |
0,8(0,8;0,9)0,080 |
|
0,5 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,889 |
0,8(0,8;0,8)0,061 |
0,9(0,9;0,9)0,002 |
1,0(0,8;1,0)0,022 |
|
|
1 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,8(0,8;0,9)0,009 |
1,0(1,0;1,0)0,002 |
1,0(1,0;1,0)0,002 |
|
|
2 мМ |
0,5(0,4;0,5)0,228 |
1,0(0,9;1,0)0,002 |
1,0(1,0;1,0)0,001 |
1,1(1,0;1,1)0,002 |
|
|
4 мМ |
0,4(0,4;0,5)0,497 |
1,0(0,9;1,0)0,002 |
1,0(1,0;1,0)0,002 |
1,1(1,0;1,2)0,002 |
|
Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).
Метилэтилпиридинол (синтетический антиоксидант, производное 3-оксипиридина), как и аскорбиновая кислота, усиливает действие ципрофлоксацина. Данный эффект становится статистически значимым через 12 часов после начала инкубации и сохраняется до окончания эксперимента. Указанный эффект с учетом степени угнетения развития культур можно охарактеризовать как слабый.
Таблица 4
Влияние N-ацетилцистеина на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli
|
САО, мМ |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду* |
||||
|
4 ч |
8 ч |
12 ч |
24 ч |
||
|
Штамм № 1 |
0,25 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,350 |
0,3(0,3;0,4)1,000 |
0,7(0,5;0,9)0,456 |
|
0,5 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,3)0,473 |
0,4(0,3;0,4)0,282 |
1,0(0,7;1,2)0,292 |
|
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,930 |
0,4(0,3;0,4)0,378 |
1,5(0,7;1,9)0,040 |
|
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,3)0,473 |
0,4(0,3;0,4)0,557 |
2,0(1,4;2,3)0,003 |
|
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,3)0,930 |
0,3(0,3;0,4)0,578 |
2,5(2,3;2,7)0,002 |
|
|
Штамм № 2 |
0,25 мМ |
0,3(0,2;0,3)0,525 |
0,4(0,3;0,4)0,313 |
0,4(0,4;0,5)0,109 |
0,9(0,7;0,9)0,853 |
|
0,5 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,501 |
0,3(0,3;0,4)0,765 |
0,5(0,5;0,5)0,004 |
0,8(0,8;1,0)0,901 |
|
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,3)0,943 |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
0,4(0,4;0,5)0,109 |
0,9(0,8;1,2)0,621 |
|
|
2 мМ |
0,3(0,2;0,3)0,525 |
0,4(0,3;0,4)0,313 |
0,6(0,6;0,7)0,002 |
1,2(1,1;1,2)0,094 |
|
|
4 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,179 |
0,4(0,4;0,4)0,016 |
0,6(0,6;0,7)0,002 |
1,2(1,2;1,2)0,039 |
|
|
Штамм № 3 |
0,25 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,8(0,7;0,8)0,270 |
0,8(0,8;0,8)0,130 |
0,8(0,8;0,8)0,455 |
|
0,5 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,8(0,8;0,9)0,041 |
0,9(0,9;0,9)0,002 |
0,9(0,8;0,9)0,035 |
|
|
1 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,889 |
0,8(0,8;0,9)0,009 |
0,9(0,9;0,9)0,002 |
0,9(0,9;0,9)0,013 |
|
|
2 мМ |
0,5(0,5;0,5)0,082 |
0,9(0,9;0,9)0,015 |
1,0(1,0;1,0)0,002 |
1,2(1,0;1,2)0,002 |
|
|
4 мМ |
0,5(0,5;0,5)0,082 |
1,0(0,9;1,0)0,002 |
1,1(1,1;1,1)0,002 |
1,1(1,1;1,2)0,002 |
|
Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).
Таблица 5
Влияние метилэтилпиридинола на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli
|
САО, мМ |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме(25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду* |
||||
|
4 ч |
8 ч |
12 ч |
24 ч |
||
|
Штамм № 1 |
0,25 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,3(0,2;0,3)0,155 |
0,3(0,2;0,3)0,110 |
0,6(0,5;0,9)0,901 |
|
0,5 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,3(0,2;0,3)0,155 |
0,3(0,2;0,3)0,110 |
0,8(0,7;1,0)0,321 |
|
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,3(0,2;0,3)0,155 |
0,2(0,2;0,2)0,015 |
0,4(0,3;0,5)0,091 |
|
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,3(0,2;0,3)0,155 |
0,2(0,2;0,3)0,044 |
0,5(0,4;0,7)0,571 |
|
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,572 |
0,2(0,2;0,2)0,350 |
0,2(0,2;0,2)0,004 |
0,3(0,3;0,4)0,009 |
|
|
Штамм № 2 |
0,25 мМ |
0,3(0,2;0,3)0,525 |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
0,4(0,4;0,4)0,240 |
0,8(0,6;1,0)0,665 |
|
0,5 мМ |
0,3(0,2;0,3)0,525 |
0,4(0,4;0,4)0,090 |
0,4(0,4;0,4)0,477 |
0,8(0,7;0,9)0,534 |
|
|
1 мМ |
0,3(0,2;0,3)0,525 |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
0,4(0,4;0,4)1,000 |
0,8(0,8;0,8)0,574 |
|
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,501 |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
0,3(0,3;0,4)0,270 |
0,6(0,6;0,7)0,048 |
|
|
4 мМ |
0,2(0,1;0,2)0,154 |
0,3(0,2;0,3)0,040 |
0,3(0,3;0,3)0,061 |
0,6(0,5;0,6)0,026 |
|
|
Штамм № 3 |
0,25 мМ |
0,5(0,4;0,5)0,228 |
0,8(0,7;0,8)0,197 |
0,8(0,8;0,8)0,065 |
0,8(0,8;0,8)0,162 |
|
0,5 мМ |
0,4(0,4;0,5)0,497 |
0,7(0,7;0,8)0,621 |
0,8(0,8;0,8)0,065 |
0,8(0,8;0,9)0,080 |
|
|
1 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,889 |
0,8(0,7;0,8)0,197 |
0,8(0,8;0,9)0,030 |
0,9(0,9;0,9)0,054 |
|
|
2 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,6(0,6;0,8)0,434 |
0,7(0,6;0,7)0,071 |
0,7(0,6;0,7)0,015 |
|
|
4 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,769 |
0,6(0,6;0,7)0,043 |
0,7(0,7;0,7)0,023 |
0,6(0,6;0,7)0,008 |
|
Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).
Представленные данные подтверждают тот факт, что наличие антиоксидантных свойств у вещества не определяет тип его влияния на активности антибактериального средства (в данном случае – ципрофлоксацина). Несмотря на то, что для фторхинолонов доказана ключевая роль усиления процессов свободнорадикального окисления в бактерицидном действии [4], в нашем исследовании обнаружены разнонаправленные эффекты антиоксидантов в отношении этого действия. По-видимому, вещества-антиоксиданты вызывают многоплановое действие за счет особенностей своего химического строения, касающееся не только окислительно-восстановительных процессов, но также других элементов метаболизма бактериальной клетки.
Выводы
Установлено, что аскорбиновая кислота и метилэтилпиридинол обладают слабым антибактериальным действием, сила которого прямо пропорциональна концентрациям антиоксидантов. Тиоловые антиоксиданты N-ацетилцистеин и восстановленный глутатион стимулируют развитие всех изучаемых штаммов. Выраженность пробактериального эффекта также прямо зависит от концентрации антиоксидантов. Полученные данные необходимо учитывать при назначении лекарственных средств с антиоксидантным типом действия, а также при проведении микробиологических исследований.
Рецензенты:
Карбышева Н.В., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул;
Смирнов И.В., д.м.н., заведующий кафедрой фармакогнозии и ботаники, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 15.07.2013.