Известно, что в проявлении предрасположенности к психоактивным веществам (ПАВ) и в рецидивах алкоголизма большую роль играет стресс [7], однако биологические механизмы влияния стресса на манифестацию алкоголизма изучены недостаточно, а результаты выполненных работ противоречивы.
Согласно имеющимся в литературе данным, наибольшее значение в механизмах развития зависимости от ПАВ имеет дофаминовый рецептор второго типа (DRD2, [6] и др.). Одним из интенсивно изучаемых локусов DRD2 является локус Taq 1A. Показано, что аллельная структура этого локуса играет роль в развитии многих психоневрологических заболеваний, включая и алкогольную зависимость [10, 11].
Первое экспериментальное подтверждение роли полиморфизма локуса Taq 1A DRD2 в развитии алкогольной зависимости получено на молекулярно-генетических моделях – крысах, имеющих различия в аллельной структуре указанного локуса, которые были выявлены после генетического анализа и к моменту эксперимента прошли 20 поколений [2]. Крысы с генотипом А1/А1 по локусу Taq 1A DRD2, показавшие ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 в эксперименте с принудительной алкоголизацией, являются валидной моделью для исследования факторов, определяющих предрасположенность к ПАВ.
Целью работы являлся сравнительный анализ поведения предпочитающих (ПА) алкоголь крыс и содержания норадреналина (НА), дофамина (ДФ) и его метаболита 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в центре афферентного синтеза – миндалевидном комплексе мозга (МК) до и после действия стресса.
Материал и методы исследования
Использованные в работе предпочитающие алкоголь (ПА) крысы получены из популяции крыс линии WAG/Rij после генотипирования локуса Taq 1A DRD2, скрещивания гомозиготных животных и выявления в последующем предпочтения алкоголя в тесте двух поилок. Среди крыс, имевших генотип А1/А1, для получения потомства (которое использовано для проведения данной работы) были отобраны особи (самки и самцы), имевшие высокие темпы нарастания количеств потребляемого спирта при принудительной алкоголизации в течение двух недель и с установкой двух поилок на третьей неделе эксперимента предпочитавшие пить спирт. В настоящем исследовании использовано четвертое поколение ПА крыс.
Поведение ПА крыс (всего 10 крыс в возрасте шести месяцев обоего пола) изучено с использованием теста «открытое поле». Круглое ОП представляло собой арену 1,5 м в диаметре с высотой стенок 0,8 м, дно которой имело деления на сектора. В открытом поле было очерчено 3 зоны: центральная, промежуточная (6 сегментов) и периферическая (12 сегментов). Освещение производилось 2 лампами, мощностью по 60 Вт, которые располагались на высоте 1,5 м от дна камеры над центральными сегментами поля.
Эксперимент, направленный на выяснение действия стрессорных нагрузок, проводился в три этапа:
1 этап – тестирование поведения животных в течение 5 дней;
2 этап – пятикратное в течение пяти дней воздействие стрессора;
3 этап – повторное тестирование поведенческих реакций животных в течение 5 дней.
В качестве стрессора использовали пятикратную ежедневную аудиогенную стимуляцию, которая проводилась в специальной камере (60×60×60 см) по методике Кузнецовой [3], используя «звон ключей» («keys ringing»). Звуковой сигнал имел диапазон 13–85 kHz (максимум спектра 20–40 kHz) и среднюю интенсивность 50–60 dB с величиной пиков до 80–90 дБ. Он предъявлялся в течение 1,5 минут. Наш выбор в качестве стрессорного воздействия аудиогенной стимуляции объясняется двумя обстоятельствами. Во-первых, известно, что крысы, как и другие грызуны, обладают генетически детерминированной повышенной чувствительностью к звуку, следовательно, чрезмерное его действие на организм способно сформировать выраженную стрессорную реакцию. Во-вторых, использование других стрессоров (иммобилизация, плавательный тест и др.), указание на которые содержится в работах различных авторов, упомянутых выше, приводило к противоречивым результатам исследований.
Содержание биогенных аминов и их метаболитов в МК (по 20 крыс до и после стресса, самцы и самки) определяли на ВЭЖХ (Аквилон, Россия) со спектрофотометрическим детектором (UVV-104 M). Область МК выделяли из нативного мозга и гомогенизировали в 20 объемах холодной 0,1М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1 пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта. Гомогенизат центрифугировали (при –20 °С) в течение десяти минут при 6000 оборотов в минуту. Супернатант подвергали микрофильтрации с помощью специальных наборов фирмы «Биохром» (Россия). После повторного центрифугирования пробы анализировали на содержание моноаминов (норадреналина, дофамина) и метаболита дофамина – 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК). Полученные результаты систематизировали и подвергали статистической обработке с помощью пакета программ «Statistica 6».
Результаты исследований и их обсуждение
Данные, характеризующие поведение крыс до и после стресса, представленыв таблице.
Показатели поведения предпочитающих алкоголь (ПА) крыс в открытом поле (M ± m) до и после стресса
|
Двигательная активность (количество пересеченных секторов) |
|||||||
|
Центральная зона |
Промежуточная зона |
Периферическая зона |
Суммарно по всем зонам |
||||
|
До |
После |
До |
После |
До |
После |
До |
После |
|
9,75 ± 1,06 |
12,57 ± 1,80 |
45,57 ± 7,68 |
56,94 ± 8,24 |
163,77 ± 19,91 |
170,34 ± 9,48 |
219,09 ± 27,66 |
236,88 ± 16,24 |
|
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
||||
|
Исследовательская деятельность (количество стоек) |
|||||||
|
2,77 ± 0,47 |
3,77 ± 1,08 |
5,57 ± 1,21 |
9,31 ± 2,98 |
38,62 ± 7,27 |
32,00 ± 6,62 |
45,17 ± 7,28 |
41,88 ± 8,85 |
|
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
||||
|
Длительность груминга (c) |
|||||||
|
До |
После |
До |
После |
До |
После |
До |
После |
|
0,28 ± 0,12 |
0,31 ± 0,14 |
0,42 ± 0,23 |
0,480,32 |
70,91 ± 17,11 |
66,3513,24 |
71,48 ± 17,28 |
67,1413,34 |
|
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
||||
Они демонстрируют, что общая двигательная активность крыс после воздействия стрессора увеличивается, однако выявленные различия не являются значимыми. Анализ посещений крысами различных секторов «открытого поля» показывает, что крысы до стресса преимущественно перемещаются по периферии поля, где количество амбуляций почти в три раза больше, чем их суммарное количество в центральном и периферическом секторах. После стресса общий рисунок передвижений крыс в открытом поле сохраняется, они продолжают проявлять большую двигательную активность по его периферии. Однако проявляются и определенные особенности: если до стресса процент посещений центральной и промежуточной зон поля составлял 21 % от общей двигательной активности, то после стресса он возрастает до 29 %. Это ставит вопрос – с чем связано это явление? Является ли оно проявлением «бесстрашия» или это так проявляется повышенная тревожность? Этот вопрос может быть решен при дополнительном исследовании поведения крыс в установке «приподнятый крестообразный лабиринт».
Анализ сдвигов со стороны исследовательской деятельности позволил получить данные, которые отражены в таблице. Они показывают, что количество стоек, совершаемых крысами в центральной и промежуточной зонах, возрастает, хотя выявленные различия и не являются статистически значимыми. В периферической зоне количество стоек уменьшается, а также снижается общая исследовательская деятельность. Хотя отмеченные изменения не являются статистически значимыми, они представляют определенный интерес, показывая, что посещаемость центральной и промежуточной зоны поля у этих крыс повышается. До стресса процент совершаемых стоек в центральной и промежуточной зоне поля составляет всего 12 %, а после стресса он возрастает до 31 %, т.е. увеличивается более чем вдвое.
Таким образом, после воздействия стрессора двигательная активность и исследовательская деятельность в центральной и промежуточной зонах «открытого поля» изменяются однонаправлено, т.е. возрастают. При этом при регистрации исследовательской активности этот сдвиг является более выраженным. Стремление исследовать новые пространства у мышей и крыс расценивается как признак расторможенности (дезингибиции), и это в целом может быть интерпретировано, как усиление поискового поведения [12].
Анализ длительности груминга (чесательный рефлекс) и количества его эпизодов показал, что более информативными являются величины, отражающие его длительность, которые приведены в таблице. Они выявляют общую тенденцию формируемых сдвигов, а именно она (длительность) снижается более выражено в периферической зоне. При этом в центральной и промежуточной зонах имеет место увеличение времени, которое животные затрачивают на его проведение.
После действия стрессорных нагрузок содержание дофамина в МК снижается на 33 %. В отличие от дофамина в ответ на стресс содержание норадреналина увеличивается на 17 %.
Полученные результаты можно суммировать следующим образом:
1. Исследование ориентировочно-исследовательского поведения крыс до стресса (на стадии предрасположенности) показало, что оно характеризуется большой двигательной активностью и выраженной исследовательской деятельностью.
2. После акустического стресса у крыс двигательная активность и исследовательская деятельность снижаются. При сохранении предпочтения периферической зоны «открытого поля» двигательная активность и особенно исследовательская деятельность возрастают в центральной и периферической зонах «открытого поля», что следует трактовать как проявление активного поискового поведения.
3. После акустического стресса содержание дофамина в МК снижается, а норадреналина возрастает.
Миндалевидный комплекс мозга (МК) вовлечён в центральные механизмы регуляции широкого круга физиологических процессов, начиная от деятельности отдельных органов и систем до целостных поведенческих актов, определяющих адаптацию организмов [1], а, следовательно, активно включающийся в реализацию стресс-реакций.
Обнаруженное нами повышенное содержание норадреналина, дофамина и ускоренный метаболизм последнего в МК у крыс с генотипом А1А1 [4] объясняет особенности их поведения, выявленные у «наивных» крыс, т.е. до стресса. Это находит подтверждение в высказываниях ведущих физиологов о том, что «дофамин и норадреналин причастны к активному типу поведения» [5].
Главным фактором, определяющим повышение содержания дофамина у ПА крыс, является то, что они имеют генотип А1А1 по локусу Taq 1A DRD2. Исследованиями по молекулярной генетике показано, что аллель А1 этого локуса находится в неравновесии по сцеплению (D’ = 0,855) с минорными аллелями (Т) двух фланкирующих 6 экзон интронных локусов (rs 2283265 и rs 1076560) этого гена, снижающими экспрессию короткой изоформы (DRD2S). Приведенные данные [15] подтверждены и другими авторами, показавшими наличие неравновесия по сцеплению между локусами rs1800497 and rs2283265 (D› = 0,78). Так как DRD2 у крысы на 95 % гомологичен с этим геном человека [9], можно полагать, что выявленная закономерность имеет место и у крыс. Известно, что снижение экспрессии короткой изоформы DRD2 и изменение в силу этого соотношения длинной и короткой изоформ приводит к повышению содержания внеклеточного дофамина [8,14].
Рецензенты:
Каюмов Ф.А., д.м.н., профессор кафедры гистологии, Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа;
Ямалеева А.А., д.б.н., профессор кафедры биохимии, Башкирский государственный университет, г. Уфа.
Работа поступила в редакцию 11.07.2013.