Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Современная медицина предлагает большое количество методов для терапии раневых процессов различной этиологии, преимущественно обусловленных микрофлорой и развитием воспалительной реакции. Разработано и предложено множество антимикробных препаратов, однако явление резистентности у микроорганизмов к используемым лекарственным препаратам, снижение общей и местной иммунологической активности требуют совершенствования уже имеющихся и поиска новых методов лечения и препаратов, способных оказывать комплексное антибактериальное, противовоспалительное и репаративное воздействие [1, 2].

Незаменимой лекарственной формой в лечении раневых повреждений остаются мази, кремы и гели, интерес к которым в последние годы сильно возрос в связи с новой тенденцией включения в их состав фитопрепаратов разной степени очищенности. Препараты растительного происхождения проявляют себя в качестве основных действующих компонентов. Они оказываю мягкое действие и малую токсичность на фоне высокой эффективности, где комплекс биологически активных веществ оказывает разностороннее и взаимодополняющее действие. Это дает возможность использовать их длительно и без возникновения побочных явлений [10].

В народной медицине трава прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) широко известна как противовоспалительное, антисептическое и ранозаживляющее средство, на чем основано его использование при лечении кожных заболеваний. С этой целью свежие измельченные листья прикладывают к гнойным ранам для их очищения и заживления [12].

Цель данного исследования состояла в изучении ранозаживляющей активности фитогеля густого экстракта травы прозанника крапчатого.

Материалы и методы исследований

Объектом наших исследований явилась трава прозанника крапчатого, заготовленная на территории Курской области в 2012 году в период массового цветения растений, из которых готовили фитогель.

При создании фитогеля большое внимание уделялось подбору компонентов основы, в которую вводились лекарственные вещества. Отсутствие токсичности, соответствие нормам микробиологической чистоты, физиологическая инертность, устойчивость определило наш выбор в пользу 5 % натрий карбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ). Обладая адсорбционными свойствами, как и другие водорастворимые эфиры целлюлозы, NaКМЦ поглощает различного рода выделения поврежденной кожи и создает защитную пленку на ее поверхности [6, 7, 14].

Фитопрепарат готовили из расчета 5 % геля NaКМЦ, в который вводили в различных концентрациях густой экстракт травы прозанника крапчатого.

Установление оптимальной концентрации геля с густым экстрактом исследуемого растения и определение спектра его антимикробной активности осуществляли в опытах in vitro методом диффузии в агар на плотных питательных средах с использованием тест-штаммов микроорганизмов. Чувствительность определяли по отношению к грамположительным (Staphylococcus aureus ATCC 6538-P), грамотрицательным (Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris NCTC 4636 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) микроорганизмам, спорообразующей культуры Bacillus cereus ATCC 10702. Фунгицидную активность изучали относительно дрожжеподобного гриба рода кандида (Candida albicans ATCC 885-653) [8].

Культуры предварительно выращивали на мясопептонном агаре в течение 24–48 ч. Смыв тест-штаммов микроорганизмов производили стерильным изотоническим раствором натрия хлорида и разводили согласно стандарту мутности Государственного контрольного института медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича до необходимой концентрации 1 млрд микробных тел в 1 мл.

Расплавленные питательные среды охлаждали до (40 ± 1) °С, засевали их со ответствующей тест-культурой и разливали по 10 мл в чашки Петри, установленные на горизонтальной плоскости, затем подсушивали в термостате в течение 30 мин при (37 ± 1) °С. На поверхность засеянной среды помещали на равном расстоянии от края чашки и друг от друга стерильные цилиндры одного размера и массы. В каждый цилиндр вносили по 0,1 г исследуемого образца лекарственного препарата. Выдерживали чашки в течение 1 ч при комнатной температуре для устранения колебаний во времени между внесением экспериментального образца и началом термостатирования. Затем чашки инкубировали в термостате при (36 ± 1) °С в течение 18 ч. По истечении срока инкубации измеряли зоны ингибирования роста тест-штаммов (мм) [4].

Изучение ранозаживляющей активности проводилось в экспериментах in vivo на 54 белых крысах-самцах линии Wistar, в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях, принятой Советом Европы в 1986 г. Для исследования отбирали животных массой 180,0 ± 20,0 г без внешних признаков заболевания, прошедших карантин в виварии ГБОУ ВПО КГМУ. Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном пищевом рационе.

Животным под наркозом моделировалась инфицированная рана, для чего на выбритом от шерсти участке спины без соблюдения стерильных условий иссекали кожу с подкожной клетчаткой размером 15×15 мм. Для стандартизации условий лечения, предупреждения деформации раны, а также для предупреждения высыхания, загрязнения раневой поверхности и укусов другими животными над раной подшивали к коже «Устройство для защиты ран» [9, 11].

В соответствии с поставленной целью и задачами эксперимента животные были разделены на 3 серии по 18 в каждой, из которых контрольной была серия без лечения. В контрольной серии животным производилась только ежедневная обработка раны 3 % раствором перекиси водорода. В серии сравнения (5 % NaКМЦ) ежедневно производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода и наложение марлевой салфетки с 5 % гелем натрий карбоксиметилцеллюлозы. В серии ‒ 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого (15 % гель) ежедневно производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода и наложение марлевой салфетки с 15 % гелем на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого. Перевязки экспериментальным животным во всех сериях производили один раз в день, ежедневно в течение 10 суток.

Планиметрические исследования. Для объективной оценки скорости заживления раны по изменению ее площади использовали метод Л.Н. Поповой [4]. Площадь ран определяли следующим образом: на рану накладывали прозрачную пленку, на которую черным маркером наносили ее контур (данную процедуру выполняли поочередно всем исследуемым животным). Определив площадь ран у экспериментальных животных в каждой серии, вычисляли среднюю площадь (M ± m), процент уменьшения площади ран от исходного размера (т.е. процент заживления раны) и скорость заживления ран (т.е. процент уменьшения площади за сутки).

Микробиологическое исследование включало количественное определение микроорганизмов в динамике в 1 г ткани инфильтрата по следующей методике. После выведения животного из эксперимента в стерильных условиях осуществляли забор участка инфильтрата раны массой 0,1–0,5 г, взвешивали и вычисляли коэффициент пересчета на 1 г ткани (К). Затем участок инфильтрата раны растирали в стерильной ступке и суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида из расчета 1:10. Далее делали десятикратные разведения суспензии в изотоническом растворе натрия хлорида до 10–3, а при необходимости и более. Из каждого разведения производили посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (агар). Посевы инкубировали в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ч, затем 1 сут выдерживали при комнатной температуре. После этого производили подсчет колоний, выросших на чашке, и делали соответствующий пересчет на 1 г ткани. Подсчет колоний производили на тех чашках, где колонии росли изолированно и количество их не превышало 300 [4].

Гистологическое изучение раневых биоптатов производили на третьи, седьмые и десятые сутки от начала лечения. Животных выводили из эксперимента путем передозировки эфирного наркоза. Забор материала осуществляли путем иссечения участка мягких тканей дна и прилежащего края раны. Взятый материал сразу фиксировали в 10 % растворе ней трального формалина с последующей проводкой по восходящим спиртам и заливкой в парафин по стандартной методике. Затем изготавливали гистологические срезы толщиной 5–7 мкм. и окрашивали гематоксилином и эозином [5, 13].

Полученные данные обрабатывали статистически посредством электронных таблиц «Microsoft Excel» и «Биостатистика»: вычисляли средние арифметические, стандартное отклонение. Нормальность распределения признаков определяли по критерию Шапиро‒Уилка. Обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев для множественных выборок Крускала‒Уоллиса и Ньюмена‒Кейлса. При уровне значимости p < 0,05 выявленные различия считались статистически значимыми [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ результатов, полученных при микробиологическом исследовании, показал, что наиболее выраженной антимикробной активностью обладает гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в количестве 15 %. За исключением Proteus vulgaris, проявившего умеренную чувствительность к фитопрепарату, все остальные штаммы показали высокую чувствительность.

Из анализа данных по изменению площади ран (табл. 1) следует, что исходные экспериментальные раны у всех животных были сопоставимы по своей площади. С течением времени во всех сериях происходило постепенное уменьшение площади ран в сравнении с предыдущим сроком наблюдения.

Таблица 1

Динамика изменения площади ран у экспериментальных животных в процессе лечения (М ± m)

Примечание. ПУП – процент уменьшения площади ран. 1р < 0,05 (сравнивались между собой серия 2 и 3 с серией 1); 2р < 0,05 (сравнивались между собой серия 3 с серией 2).

В сериях 2 и 3 по сравнению с контрольной достоверное различие по проценту уменьшения площади ран отмечается с первых по седьмые сутки, на десятые сутки достоверных различий не выявлено в серии 2. Между сериями 2 и 3 достоверное различие по проценту уменьшения площади ран отмечается только на десятые сутки.

Процент уменьшения площади ран в сериях 2 и 3 близок по значениям в первые и третьи сутки. На седьмые процент уменьшения площади ран в серии 3 на 2,84 % превысил таковой в серии 2 и на 11,82 % – в серии 1.

К десятым суткам от начала лечения в контрольной серии площадь ран уменьшилась на 229,46 мм2, в серии 2 – на 235,04 мм2, в серии 3 – на 239,16 мм2.

Динамика изменения скорости заживления ран в экспериментальных сериях представлена в табл. 2. Из анализа полученных результатов следует, что скорость заживления ран в сериях 2 и 3 по сравнению с контролем достоверно выше на первые-третьи сутки.

Таблица 2

Заживление ран у экспериментальных животных в процессе лечения (М ± m)

Примечание. 1р < 0,05 (сравнивались между собой серия 2 и 3 с серией 1).

Таким образом, полученные данные планиметрического исследования подтверждают наличие ранозаживляющей активности 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого. Он способствует уменьшению площади ран к десятым суткам более чем на 96 %, тогда как 5 % NaКМЦ показывает уменьшение площади на 93,98 %. Высокая скорость заживления ран в первые семь суток наблюдения свидетельствует об активности фитопрепарата в фазу экссудации.

Результаты микробиологического исследования ран представлены в табл. 3.

Таблица 3

Динамика определения микробной обсемененности ран (M ± m)

Примечание. 1р < 0,05 (сравнивались между собой серия 2 и 3 с серией 1); 2р < 0,05 (сравнивались между собой серия 3 с серией 2).

Во всех сериях микробная обсемененность ран на первые сутки составляла в среднем 4,83 ± 0,92·108 КОЕ/г. В контрольной серии микробная обсемененность ран остается на высоком уровне на всех сроках наблюдения. В серии 2 она достоверно меньше, чем в контрольной, только на десятые сутки и составляет 4,5 ± 1,00·107 КОЕ/г, что в 3,25 раза меньше.

В серии 3 микробная обсемененность ран достоверно меньше относительно контрольной серии и серии 2 на всех сроках наблюдения. К десятым суткам микробная обсемененность достигла 10,0 ± 0,01·106 КОЕ/г, что в 14,65 и 4,5 раза меньше данных, показанных серией 1 и 2 соответственно.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует, что использование при лечении инфицированных ран геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в концентрации 15 % способствует скорейшему уменьшению микробной обсемененности ран по сравнению с использованием 5 % водного геля NaКМЦ и способствует более быстрому заживлению раневой поверхности.

Полученные результаты морфологического исследования показали, что 15 % гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого обладает хорошо выраженным стимулирующим эффектом на пролиферативную и функциональную активность клеток грануляционной ткани, который прямо пропорционален сроку эксперимента.

Несмотря на практически полное восстановление эпидермиса, произрастающего от краев раневой поверхности, на отдельных участках частично сохранился струп, в контрольной серии и серии с использованием основы в качестве 5 % раствора NaКМЦ. По визуальной оценке в грануляционной ткани на стандартной единице площади среза наблюдается более высокое содержание клеточных элементов, чем в группе с использованием 15 % геля, что говорит о меньшей степени зрелости этой ткани.

Реактивные изменения дермы, а именно ее клеточная плотность в группах контрольной серии и серии с использованием 5 % раствора NaКМЦ была значительно выше уже на начальных сроках эксперимента в сравнении с группой с использованием 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, что свидетельствует о более затяжном характере воспалительного процесса, следовательно, и о более длительном заживлении раны.

Относительно большее количество клеток фибробластического ряда у животных с использованием 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, чем в контрольной серии и серии 5 % раствора NaКМЦ также свидетельствует о повышенной регенераторной активности в этой группе.

Выявленное максимальное количество макрофагов в группах с использованием 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого также свидетельствует об ускорении процессов регенерации, так как макрофаги при репаративных и патологических процессах не только модулируют пролиферативную и синтетическую функции фибробластов, но и путем паракринной стимуляции активизируют миграцию и пролиферацию эндотелиоцитов, процессы ангиогенеза.

Таким образом, использование 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого уменьшает воспалительные изменения, активизирует макрофагальную реакцию, восстанавливает нарушенные межклеточные взаимодействия, усиливает ангиогенез, пролиферацию и дифференцировку фибробластов, синтез и секрецию коллагена, процессы фибриллогенеза, созревание и ремоделирование грануляционной ткани и ее эпителизацию.

Выводы

1. Установлена оптимальная концентрация геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, оказывающая антибактериальное и стимулирующее действие при заживлении ран, на основании чего определен состав фитопрепарата для терапии раневого процесса.

2. Согласно результатам планиметрического исследования, 15 % гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого способствует уменьшению площади ран к десятым суткам более чем на 96 %, тогда как основа – 5 % раствор NaКМЦ показывает уменьшение площади на 93,98 %.

3. Высокую чувствительность к 15 % гелю на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого показали тест-штаммы Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Bacillus cereus ATCC 10702 и Candida albicans ATCC 885-653. В отношении микроорганизмов Proteus vulgaris NCTC 4636 был отмечен умеренный рост, определяющий умеренную чувствительность к исследуемому фитопрепарату.

4. В опытах in vivo 15 % гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого оказывал выраженное бактерицидное действие на клетки, что способствует скорейшему уменьшению микробной обсемененности и более быстрому заживлению раневой поверхности. На десятые сутки наблюдения у крыс, получавших лечение 15 % гелем на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, микробная обсемененность ран снижалась в 14,65 раз по сравнению с контролем без лечения.

5. Исследование морфологической картины репаративной регенерации тканей после моделирования инфицированной раны в контрольной группе и группе, получавшей 5 % гель NaКМЦ, позволяет сделать вывод об эффективности применения 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в качестве противовоспалительного и ранозаживляющего средства.

Рецензенты:

Хабаров А.А., д.фарм.н., профессор кафедры общей химии, ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск;

Сипливая Л.Е., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск.

Работа поступила в редакцию 07.06.2013.