В норме нейтрофилы в сосудистом русле существуют около 0,5–2 сут, затем стареют и подвергаются спонтанному (или конститутивному) апоптозу, который регулируется механизмом, заложенным в самих нейтрофилах [2]. Первым этапом изменений является расщепление находящейся в цитозоле молекулы Bid каспазой 3, обусловленное каспазой 2, а также гранзимами, кальпаином и катепсином. Расщепленные молекулы tBid перемещаются к митохондриям, где гетеродимеризуются с молекулами Bax. Комплекс tBid-Bax изменяет на внешней мембране митохондрий (ВММ) потенциал VDAC (voltage-dependent anion channel), что способствует образованию в ней пор (каналов) [25]. Диаметр неактивированной поры VDAC составляет 2,6–3 нм, что не позволяет выходить в цитозоль совокупности про- и антиапоптозных белков, располагающихся в межмембранном пространстве митохондрии. После встраивания во внешнюю мембрану митохондрии (МХ) комплекса tBid-Bax и использования липидной подложки происходит расширение пор МХ, через которые из межмембранного пространства МХ выходит ряд таких проапоптозных веществ, как AIF, эндонуклеаза G, Smac/Diablo, цитохром С, молекулы Bad, Omi/HtrA2, Smac/Diablo [1], а также антиапоптозные белки – Bcl-2 (21 кД), Bcl-xL (29 кД), Mcl-1 (37–44 кД), Bfl-1/А1 (20 кД). Антиапоптозные белки являются антиоксидантами и блокируют образование пор в мембране МХ. Они способны поддерживать целостность МХ напрямую, ингибируя инициаторные каспазы [1], которые модифицируют активность клеточных белков (полимераз, 2 эндонуклеаз), а также компонент ядерной мембраны, ответственных за фрагментацию ДНК в апоптозных клетках.
Белки Bcl-xL и Bcl-2 содержат 4 ВН-домена, а также loop- и трансмембранный (TM) домены, в результате образуется последовательность: N – BH4 – loop – BH3 – BH1 – BH2 – TM – COOH. Через домен BH4 происходит связывание и ингибирование прокаспазы 9, а домен BH3 используется при олигомеризации молекул. Свойства доменов BH1 и BH2 исследованы слабо. Домен loop у белков Bcl-2 и Bcl-xL различается в основном значением PI – изоэлектрической точки. Показано, что каспазное расщепление по домену loop превращает антиапоптозные белки Bcl-2 и Bcl-xL в Bax-подобные проапоптозные [28]. После миграции к МХ мембране функциональная активность белка Bcl-xL наблюдается только в комплексе с tBid. Показано, что белокBcl-2 почти полностью отсутствует в зрелых клетках. Его потеря приводит к увеличению экспрессии генов каспаз 1 и 3 [4]. Белок Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1) находится во многих тканях организма млекопитающих. Он необходим как для эмбрионального развития, так и для функционирования иммунной системы, и является одним из основных антиапоптозных белков в нейтрофилах, что спососбствует выживанию клетки на ранней стадии апоптоза. Белок Mcl-1 характерен коротким временем жизни и быстро расщепляется каспазами во время апоптоза [Michels 24]. Этот белок имеет три домена BHs (s = 1, 2, 3), располагается на мембранах МХ и клеточного ядра, но при низком содержании МХ – преимущественно на ядерной мембране. Регулирование уровня содержания этого белка на мембране МХ происходит за счёт комплексирования с трёхдоменными проапоптозными белками [39], на ядерной мембране – через протеасомы [12]. Показано, что усиление протеасомного расщепления определяется посттранскрипционным действием цитокинов и изменением локальной концентрации кислорода. Характерной особенностью белка Mcl-1 является малое время жизни, составляющее 2–3 ч, действие его проявляется только на ранней стадии апоптозных событий, а именно при выходе из митохондрий цитохрома с; во время апоптоза он быстро расщепляется [22].
Убиквитинизации белка Mcl-1 способствует белок, называемый Mule, который обеспечивает полиубиквитинизацию Mcl-1 по пяти лизинам. Взаимодействие белков Mcl-1 с Mule происходит через регион, схожий с BH3-доменом белков Bcl-2-семейства. Удаление Mule приводило к ослаблению апоптоза, вызываемого применением ДНК-повреждающих агентов [39], применение стауроспорина (ингибитора протеинкиназ) уменьшало уровень мРНК белка Mcl-1, применение окадаидной кислоты (фосфатазного ингибитора) существенно усиливало обращение белка Mcl-1 и его апоптоз, применение кальпаина не изменяло стабильности его уровня [16].
Белок Bfl-1/A1 – менее мощный антиапоптозный фактор, чем Mcl-1, он действует, ингибируя связь между молекулами Bax или Bak и молекулой tBid [20].
Этот белок имеет только два ВН-домена – BН1 и ВH2, гомологичных таким же доменам белка Bcl-xL, и присутствует преимущественно в клетках системы крови и эндотелии. Наличие Bfl-1/A1 удлиняет время жизни нейтрофилов. Особо отмечается роль этого фактора в защите от р53-обусловленного апоптоза [11].
Белки, способствующие апоптозу
К проапоптозным белкам относятся следующие белки: Bax (24,2 кД), Bak (23,4 кД), Bok, Bad (18,4 кД), Bik (18 кД), Bid (26,8 кД), Bim (22,17 кД), Puma (20,5 кД), Noxa (6 кД), Bmf (21,5 кД), содержащие различное количество доменов ВН (Bcl-2 homology), что определяет различие их функций. Эту группу белков подразделяют на мульти- и однодоменные. К мультидоменной группе относятся белки Bax, Bak и Bok, имеющих три ВНi-домена (i = 1–3). Белки Bax и Bak являются основными компонентами комплекса, приводящего к образованию пор в митохондриях. В физиологических условиях мультидоменный белок Bax находится в цитозоле, но при апоптозных стимулах перемещается к МХ. Показано, что к функциональной активности этого белка приводит прямое связывание с BH3-доменом модификации белка Bid (tBid), происходящее на поверхности МХ [35]. На ней же также активируются и олигомеризуются проапоптозные белки Bax и Bak [Arniult? 3]. Также способствует апоптозу сравнительно недавно открытый белок Bok/Mtd (Bcl-2-related ovarian killer/Matador). Количество этих молекул незначительно в покоящихся клетках и увеличивается при появлении проапоптозных стимулов. Показано ингибирование апоптоза при гетеродимеризации проапоптозных белков Bax и Bak с антиапоптозными белками Bcl-2 и Bcl-xL, а белка Bok – с белком Mcl-1.
К группе проапоптозных белков, имеющих в своей структуре только один модуль BH3 (BH3-only) относятся: Bid, Bim, Bad, Bik, Hrk, Blk, Puma, Noxa, Bmf. Специфика механизмов их действия определяется различиями по аминокислотным последовательностям.
Bid. При рецептор-зависимом апоптозе каспаза 8 расщепляет молекулу Bid на два фрагмента 6,5 кД (N-конец) и 15 кД, содержащий BH3 домен (tBid), который образует комплекс с трёхдоменными Bak или Bax, что способствует формированию пор МХ [4, 29]. Показано, что домен tBid способствует разрушению целостности клетки, воздействуя через кардиолипин МХ мембраны [32]. Однако известно образование комплекса tBid и с антиапоптозными белками – Bcl-2 или Bcl-xL, а также их взаимодействие с митохондриальными липидами, к числу которых относится лизофосфатадилхолин (LPC1). tBid связывается с Bcl-xL более сильно, чем Bid полной длины [13]. Получившийся комплекс влияет на проницаемость внешней мембраны МХ.
В динамике взаимодействия между Bid и Bax во время TNFα-апоптоза установлено различное его течение в разных клетках. В ASTCa1-клетках Bid полной длины индуцировал транслокацию Bax к МХ после непосредственного с ним взаимодействия. Расщепления белка Bid в ASTCa1- и HeLa-клетках не происходило даже при условии активации каспазы 8, а в MCF7-клетках – наблюдалось. В ASTCa1-клетках активация каспазы 3 была бифазна, и Bid был расщеплён только после вторичной активации каспазы 3. Поэтому считают, что нерасщеплённый Bid непосредственно регулирует активацию Bax в ASTCa1-клетках. Bid расщепляется при апоптозе, активированном ROS [7].
На примере белков семейства Bcl-2 выявлены некоторые различия в функциях различных однодоменных белков. Если белок Bid является как бы сенсором, подводящим сигнал к мультидоменным проапоптозным белкам Bax и Bak, то индуцируется олигомеризация названных молекул, в этом случае белки Bim, Bad и Bik, способствуют апоптозу, ингибируя антиапоптозные белки.
Bad. Выявлено, что проапоптозная функция белка Bad усиливается при дефосфориляции и ослабляется под действием факторов роста, приводящих к фосфорилированию по серинам 112 и 136 через PI3k/Akt-сигнальный путь. Дефицит факторов роста воспринимается клеткой как сигнал к апоптозу. Будучи фосфорилированным, белок Bad теряет апоптогенные свойства, связываясь сильно с Bcl-xL и с Bcl-2 и Bcl-w. Также выявлено, что имеет место слабая связь с A1 и полное её отсутствие с Mcl-1, а также отсутствие связи с Bcl-2 и Bcl-w [9]. При дефосфорилировании происходит ослабление связывания белка Bad с Bcl-xL, что способствует транслокации комплекса c поверхности митохондрии в цитозоль [14].
Найдены три изоформы белка Bim: BimS (short) (112 аминокислот (ак)), 12, 3 килодальтон (кД)), BimL (long) (193 ак, 15,8 кД), BimEL (extra long) (198 ак, 22 кД). Короткая форма (BimS) мощно индуцирует апоптоз и нормально, но только преходяще экспрессируется в клетках при апоптозе. Длинные изоформы (BimL, BimEL) экспрессируются в нормальных клетках, их апоптозная активность угнетается связыванием с dynein motor-комплексом. В формах BimL и BimEL присутствует короткий пептидный мотив (DKSTQTP), отсутствующий в BimS. Этот мотив определяет связывание Bim с DLC1, его отсутствие в BimS относят на счёт очень высокой апоптозной активности этой изоформы. При апоптозе, обусловленном действием фактора TNFα, не наблюдали коиммунопресипитации Bax с BimL, это позволило предположить, что BimL и сам перемещается к митохондрии и способствует перемещению Bax во время TNFα-апоптоза. Было отмечено увеличенное взаимодействие между Bcl-xL и BimL и слабое – между Bcl-xL и Bax [37]. Показано, что белок BimL может активировать проапоптозный Bax, который определяет митохондриальный путь апоптоза.
Близок к белку Bim по функциям белок Bmf, в котором содержится мотив (DKATQTLSP), связывающий DLC2-компоненту myosin V motor-комплекса. При нормальных условиях BH3-only белки Bim и Bmf секвестируются во взаимодействующих с цитоскелетом motor-комплексах, из которых они выходят при апоптозных стимулах, механизм их выхода ещё не выяснен.
Белки Noxa и Puma нейтрализуют Mcl-1 и Bcl-xL и способствуют перемещению к митохондрииям белков Bak и Bim [23]. Белок Bik, принадлежащий этому же семейству, противостоит антиапоптозным Mcl-1 и Bcl-xL и активирует Bak-обусловленный апоптоз в ответ на ингибирование синтеза белков [29].
Установлены следующие данные о специфике действия однодоменных проапоптозных белков. При апоптозе, обусловленным ингибированием синтеза белка, Bik (но не Bim, Puma или Noxa) противостоит антиапоптозным белкам Mcl-1 и Bcl-xL и активирует Bak-обусловленный апоптоз, а связывание Bak с Mcl-1 продолжается после экспрессии Bik и ингибирует Bik-индуцируемый апоптоз в Bax-дефицитных клетках. Напротив, белок Puma разрушает Mcl-1-Bak взаимодействие и запускает апоптоз через Bax и Bak. Показано, что при апоптозе нейронов, инициированном оксидативным стрессом, участвуют белки Bim, Puma, и Noxa, а в регулировании Bax-активации доминантную роль играет белок Puma. После ассоциации c Puma белок Bax приобретает способность проникать сквозь внешнюю митохондриальную мембрану [28].
Белки Noxa и Puma функционируют при p53-апоптозе. Noxa, Puma и BimL могут связывать антиапоптозный Bcl-xL, они нейтрализуют белки Mcl-1 и Bcl-xL и способствуют перемещению к митохондриям белков Bak и Bim. При эктопической экспрессии белка Noxa его локализация с митохондрией (также при взаимодействии с антиапоптозными членами Bcl-2 семейства) происходит через BH3 мотив Noxa. Показано, что блокирование эндогенной индукции Noxa приводит к угнетению апоптоза [15]. Известно, что белки BH3-only связываются с антиапоптозным Mcl-1 через амфипатические альфа-геликсы в гидрофобной канавке. При сравнении термодинамических параметров этого связывания, определяемых калориметрическими методами, показано, что белки Noxa и Puma связывают с афинностью на 3 порядка выше белок Mcl-1, чем белки Bmf, Bim, Bid, Bak. Причём показано, что белок Noxa единолично связывает только Mcl-1 и A1 [38]. Белок Puma играет доминантную роль в регулировании Bax-активации, причём индукция этого белка, но не Bim или Noxa необходима и достаточна для индуцирования конформационных изменений в белке Bax при придании ему активного состояния и способности проникновения через мембрану. Интересны следующие данные. Белки и Puma и Bim могут связывать антиапоптозный Bcl-xL, но с Bax оказался способным связываться только белок Puma. Такое различие предполагает, что Puma может играть доминантную роль в комплексировании с Bax.
На примере белков семейства Bcl-2 выявлены некоторые различия в функциях различных однодоменных белков. Если белок Bid является как бы сенсором, подводящим сигнал к мультидоменным проапоптозным белкам Bax и Bak, то индуцируется олигомеризация названных молекул, в этом случае белки Bim, Bad и Bik способствуют апоптозу, ингибируя антиапоптозные белки.
Взаимодействия про- и антиапоптозных белков при инициации апоптоза
При нормальных условиях однодоменный белок Bak связывается с Mcl-1 и Bcl-xL, но не с Bcl-2, A1. Эта связь осуществляется через BH3-домен белка Bak. Активированные белком Bak BH3-only белки (Noxa или Bad), ассоциируясь с Mcl-1 или Bcl-xL, перемещаются к митохондриям и индуцируют апоптоз. Выяснено, что наличие BH3–only белка запирает BH3-домен в гидрофобной канавке антиапоптозной мишени (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, and A1) [8]. Белки Bim и Puma запирают все антиапоптозные белки, Bad – только Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, а Noxa – преимущественно Mcl-1 и A1 [20]. Известны случаи индуцирования апоптоза белком Bak в отсутствие связывания с Mcl-1 или Bcl-xL [27].
В результате взаимодействия с другими про- и антиапоптозными белками у BH3-only белков выяляется ряд новых свойств, чему способствует наличие белка tBid. За счёт этого после миграции к митохондриальной мембране функциональная активность белка Bax. наблюдается только в комплексе с tBid. Другой особенностью является то, что 5,5 деградация белка Mcl-1 стабилизируется при ассоциации с Bim, но усиливается при ассоциации с Noxa. Mcl-1 содержит один специфический антиапоптозный Bcl-2-подобный регион BLR (50 ак) и другой такой же, как и во всех членах Bcl-2 семейства, который располагается в N-терминальном домене и содержит около 170 аминокислот [8]. Показано, что связывание Mcl-1 с BH3-доменом белка BimS (или Noxa), приводит к потере у Mcl-1 последовательности, необходимой для его протеасомной деградации. Причём, хотя BimS и усиливает killing-способность нейтрофилов, но его сверхэкспрессия (как и белка Puma) не проявляется в киллинге Mcl-1 [8, 24]. Установлено также, что гетеродимеризация проапоптозного белка Bok с Mcl-1 или Bfl-1/A1 ингибирует апоптоз, а белок Bfl-1 взаимодействует с Bak и tBid, но не с Bax или Bid. Bfl-1 блокирует TNFα-индуцируемую активацию Bax через ассоциацию с tBid. Bfl-1 использует различные механизмы угнетения апоптоза в зависимости от стимула. Этот белок ассоциируется с tBid, препятствуя активации проапоптозных Bax и Bak, и также прямо взаимодействует с Bak при ингибировании Bak-обусловленного апоптоза подобно Mcl-1 [35]. Показано, что такой физиологический стимул, как увеличение содержания кальция специфически индуцирует эндогенный Bim, ведет к Bim-зависимой клеточной гибели без элиминации Mcl-1 [5].
Рецензенты:
Чемерис Н.К., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник ИБК РАН, г. Пущино;
Винокуров М.Г., д.б.н., заведующий лабораторией ИБК РАН, г. Пущино.
Работа поступила в редакцию 07.06.2013.