Постоянство внутренней среды организма в ответ на меняющиеся метаболические процессы и условия внешней среды поддерживается различными химическими веществами, среди которых такие как натрий, калий, кальций, фосфор, хлор, водород, кислород, азот являются основными и жизненно необходимыми. Поэтому значительные изменения их содержаний как в сторону повышения, так и снижения приводят к серьезным нарушениям здоровья.
Кальций, на долю которого в организме человека приходится около 1,5 кг, нельзя охарактеризовать только словами «очень важный», так как проще не назвать те процессы, в которых он не принимает участия, чем перечислить все, нормальное течение которых возможно только в присутствии ионов кальция. Отсюда очевидна целесообразность изучения функционирования различных органов и систем в условиях измененного обмена кальция, в частности, при гипер- и гипокальциемии. А среди причин, способных привести к этим патологическим состояниям, могут быть различные заболевания почек, печени, костей, кишечника, изменение содержаний паратгормона, кальцитонина, кальцитриола или чувствительности к ним и многое другое [4].
Целью работы было выяснение влияния экспериментальной гипокальциемии, создаваемой путем удаления паращитовидных желез, на функции почек, их морфологическую характеристику и состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы.
Материал и методы исследования
В качестве материала для исследования были взяты биологические пробы (кровь, моча и почки) от 50 лабораторных крыс линии Вистар (20 контрольных и 30 экспериментальных).
Одной из наиболее эффективных моделей, способствующих развитию гипокальциемии, является оперативное удаление паращитовидных желез. Крысам, наркотизированным внутрибрюшинным введением золетила (Zoletil, Франция) в дозе 0,1–0,15 мл одной крысе, производили воротникообразный разрез в области шеи, выделяли щитовидную железу и в ее толще по обе стороны от срединной доли находили (как правило, по две штуки) паращитовидные железы, которые выжигали термокаутером. Выживаемость крыс в первые сутки после операции составляла от 80 до 90 %. В дальнейшем гибели крыс не отмечалось. По прошествии 5–6 недель, времени, необходимого для развития гипокальциемии, в случае, если наше оперативное вмешательство оказывалось успешным, у крыс появлялись такие характерные признаки гипокальциемии, как судорожная готовность, выпадение шерсти, катаракта. Но основным критерием гипокальциемии было сниженное содержание кальция в плазме крови, которую брали из хвостовой вены. Из 28 крыс, выживших после паратиреоидэктомии, в эксперимент были взяты только 21, у которых концентрация кальция в плазме крови была 1,72 ± 0,18 ммоль/л, а у оставшихся 7-и крыс – 2,18 ± 0,16 ммоль/л, что было близко к результатам интактных крыс контрольной группы (2,32 ± 0,19 ммоль/л), поэтому они не были взяты в опыт. Все животные на протяжении всего эксперимента имели свободный доступ к воде и пище, который соответствовал стандартному рациону, освещение вивария было приближено к затемненному, как естественному для грызунов.
При проведении опытов крыс на шесть часов помещали в специальные клетки-воронки для сбора мочи, в которой спектрофотометрически определяли содержание эндогенного креатинина (метод Поппера), общего белка (метод Лоури), кальция и фосфора с помощью эриохрома синего и молибденовокислого аммония [9]. По общепринятым формулам [8] рассчитывали: диурез, скорость клубочковой фильтрации и объём канальцевой реабсорбции воды, фильтрационный заряд, канальцевую реабсорбцию и экскрецию с мочой кальция и фосфора. В плазме крови крыс, декапитированных при завершении опытов, определяли содержание креатинина, общего белка (биуретовый метод), кальция и фосфора, гидроперекисей, а в эритроцитах – малонового диальдегида [6], активность каталазы и супероксиддисмутазы [2].
Полученные результаты статистически обрабатывались с помощью компьютерной программы «GraphPad Prizm 5.03», а степень достоверности используемого параметрического метода сравнения оценивалась по t-критерию Стьюдента.
Почки крыс после соответствующей подготовки с последующей окраской срезов гематоксилин-эозином изучались морфологически с помощью световой микроскопии.
Результаты исследования и их обсуждение
Через полтора месяца после паратиреоидэктомии спонтанный диурез у экспериментальных крыс достоверно (р < 0,001) повысился с 0,19 ± 0,01 мл/ч/100 г до 0,27 ± 0,012 мл/ч/100 г, что было обусловлено снижением (р < 0,001) канальцевой реабсорбции воды (98,88 ± 0,07 % – контроль, 98,06 ± 0,09 % – опыт, p < 0,002), так как скорость клубочковой фильтрации особо не изменилась (12,83 ± 0,94 мл/ч/100 г – контроль, 14,08 ± 1,12 мл/ч/100 г – опыт).
Исследование содержания креатинина в плазме крови как одного из показателей нормальной работы почек выявило его достоверное (р < 0,002) повышение у гипокальциемических крыс с контрольного уровня интактных крыс в 72,64 ± 2,28 мкмоль/л до 84,64 ± 2,94 мкмоль/л через полтора месяца после удаления паращитовидных желез.
Изменение водовыделительной функции почек сопровождалось значительной протеинурией (8,35 ± 0,58 мкг/мл – контроль, 19,82 ± 0,84 мкг/мл – опыт, р < 0,001). Очевидно, что такая потеря белка с мочой, превосходящая норму в 2,4 раза, способствовала тому, что его содержание в плазме крови начало уменьшаться (64,09 ± 2,31 г/л – контроль, 58,77 ± 1,98 г/л – опыт).
Концентрация общего кальция в плазме крови опытных крыс в 1,79 ± 0,15 ммоль/л по сравнению с нормой в 2,32 ± 0,19 ммоль/л было меньше на 34,8 % (р < 0,05), что для такого относительно постоянного показателя как уровень кальция в крови ‒ значительное уменьшение [5, 10]. Изучение обработки кальция в почках выявило снижение (р < 0,001) фильтрационного заряда с контрольной величины в 24,42 ± 1,58 мкмоль/ч/100 г до 14,34 ± 1,08 мкмоль/ч/100 г, что при уменьшении скорости клубочковой фильтрации и содержания кальция в крови является закономерным. Но, несмотря на снижение количества кальция, профильтровавшегося в клубочках нефронов, в результате того, что одновременно тормозилось его обратное всасывание в канальцах почек (р < 0,001), экскреция кальция с мочой у гипокальциемических крыс повысилась (0,55 ± 0,027 мкмоль/ч/100 г – контроль; 0,64 ± 0,03 мкмоль/ч/100 г – опыт, р < 0,05).
Обмен кальция в организме человека и млекопитающих нельзя рассматривать отдельно без обмена фосфора, и из 98 % кальция костей, 85 % приходится на ортофосфат Са3(РО4)2. И если удаление паращитовидных желез привело к гипокальциемии, то в отношении неорганического фосфора, наоборот, произошло повышение (р < 0,002) его уровня в плазме крови с 1,36 ± 0,09 ммоль/л (контроль) до 1,94 ± 0,14 ммоль/л (опыт), и вместе с тем изменилась его экскреция с мочой. Хотя фильтрационный заряд фосфора, несмотря на снижение клубочковой фильтрации, но в результате гиперфосфатемии, не изменился (17,52 ± 1,36 мкмоль/ч/100 г – контроль, 18,97 ± 1,54 мкмоль/ч/100 г – опыт). Но так как канальцевая реабсорбция фосфора с контрольного уровня в 95,07 ± 0,35 % достоверно (р < 0,01) повысилась до 96,59 ± 0,42 %, то его экскреция соразмерно (р < 0,01) снизилась (0,87 ± 0,03 мкмоль/ч/100 г – контроль, 0,65 ± 0,03 мкмоль/ч/100 г – опыт).
Отмеченное повышение содержания фосфора в плазме крови в свою очередь способствует усилению гипокальциемии, а низкий уровень паратгормона, который должен быть после удаления паращитовидных желез, снизит активность 1-гидроксилазы, фермента, превращающего 25-гидроксивитамин D в его активную форму – 1,25-(OH)2 D3 или кальцитриол, и поэтому произойдет уменьшение всасывания кальция из кишечника, что усилит гипокальциемию [1].
Изучение влияния гипокальциемии на перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот, о котором мы судили по содержанию в плазме крови гидроперекисей и малонового диальдегида в эритроцитах, выявило усиление окислительной деградации липидов, и уровень гидроперекисей с контрольной величины в 4,66 ± 0,21 мкмоль/л повысился до 7,63 ± 0,42 мкмоль/л (на 63,7 %, р < 0,001). Достоверно (р < 0,01) увеличилось и содержание малонового диальдегида с 32,45 ± 2,28 мкмоль/л (контроль) до 47,63 ± 2,68 мкмоль/л (опыт), но в процентном отношении по сравнению с гидроперекисями оно было в меньшей степени (на 46,8 %). Одновременно с усилением пероксидации липидов снижение содержания кальция в плазме крови на антиоксидантную защиту клеток оказало ослабляющее действие, и активность супероксиддисмутазы (контроль – 68,84 ± 2,49 ед. ингибир., опыт – 50,81 ± 2,67 ед. ингибир., р < 0,001) и каталазы (контроль – 7,18 ± 0,29∙10–4 МЕ/г Hb, опыт – 4,71 ± 0,25∙10–4 МЕ/г Hb, р < 0,001) были снижены.
Полученные нами результаты состояния перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты аналогичны изменения, отмеченным у подростков с эссенциальной артериальной гипертензией и сниженным содержанием общего кальция в крови [7], а также у беременных с поздним гестозом и гипокальциемией [3]. При этом применение аскорбиновой кислоты и витамина D3 уменьшает степень накопления продуктов пероксидации.
Морфология почек крыс через полтора месяца после паратиреоидэктомии. Окраска гематоксилин-эозином. х600
Морфологическое исследование почек у крыс с гипокальциемией выявило увеличение клубочков, имеющих разную степень расширения полости, с накоплением депозитов и отеком мезангия. Эпителий канальцев коркового вещества имел дистрофические изменения с апикальной деструкцией и частичным пикнозом ядер, а в отдельных участках с явлениями кариолизиса. Просвет канальцев местами был расширен и заполнен десквамациями. В периваскулярных пространствах отмечались очаговые воспалительные инфильтраты. В канальцах мозгового вещества почек также имелись разнообразные дистрофические изменения, с расширением просвета и накоплениями в них аморфных и плотных гиалиновых масс. В интерстициальном пространстве наряду с дистрофическими изменениями отмечались воспалительные инфильтраты и застойное полнокровие в сосудистой системе.
Таким образом, удаление паращитовидных желёз у крыс линии Вистар вызывает: гипокальциемию и гипокальциурез; гиперфосфатемию и гипофосфатурез; протеинурию; увеличение содержания креатинина в плазме крови; повышение спонтанного диуреза в результате уменьшения канальцевой реабсорбции воды; усиление перекисного окисления липидов и ослабление антиоксидантной защиты; дистрофические изменения клубочков и эпителия канальцев нефронов, с застойными и воспалительными явлениями.
Рецензенты:
Бибаева Л.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой биологии и гистологии ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Минздрава России». г. Владикавказ;
Урумова Л.Т., д.м.н., доцент кафедры патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Минздрава России», г. Владикавказ.
Работа поступила в редакцию 18.06.2013.