Актуальной проблемой медицины является расшифровка механизма действия биологически активных веществ эндогенного происхождения, способных выступать в роли мультипотентных регуляторов гомеостаза. Ранее нами убедительно продемонстрирована роль белков острой фазы церулоплазмина и альфа-1-кислого гликоапротеина в регуляции активности единой клеточно-гуморальной защитной системы организма [2-7, 13]. В последние годы объектом пристального внимания многих отечественных и зарубежных исследователей выступает эритропоэтин [1]. Нами показано участие эритропоэтина (ЭПО) в коррекции аффективного статуса у больных хронической почечной недостаточностью [11]. По нашим данным, ЭПО снижает выраженность геморрагического синдрома у больных хронической почечной недостаточностью, регулирует функциональную активность тромбоцитов и плазменных протеолитических систем при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и экспериментальных условиях [8–10, 12]. Возникает вопрос о возможности регуляторного влияния ЭПО на активность тромбоцитов и плазменных систем гемостаза и антигемостаза в интактных условиях вне зависимости от наличия патологии. Цель работы – исследовать влияние ЭПО на функциональную активность тромбоцитов и плазменных систем гемостаза и антигемостаза в экспериментальных условиях in vitro.

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели использована цельная кровь 96 клинически здоровых добровольцев-доноров Челябинской областной станции переливания крови и 30 больных ХПН, не принимающих ЭПО, находящихся на лечении гемодиализом в ГБУЗ ЧОКБ. Стабилизацию крови осуществляли 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 1:5 для исследований агрегации тромбоцитов и 1:9 – для исследований коагуляционного гемостаза. ЭПО в форме препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) применяли в концентрациях 30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/л, что соответствует 200, 100, 50, 25, 12,5 % от его нормальной концентрации в сыворотке. После добавления ЭПО плазму инкубировали в условиях термостата при температуре 37 °С в течение 30 мин. АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью двуканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «LA-230» (Россия). Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Затем получали бедную тромбоцитами плазму (БТП), для чего остаток центрифугировали в течение 15 минут, при 4500 об/мин. Смешиванием ОТП и БТП получали тромбоцитарную плазму с концентрацией тромбоцитов 300∙109/л. В качестве индуктора агрегации использовали динатриевую соль АДФ в концентрации 0,109 М. Регистрировали амплитуду агрегации (%), время агрегации (мин), скорость агрегации (% мин). Для исследования коагуляционного гемостаза плазму получали путем центрифугирования цельной крови при 3000 об/мин в течение 15 мин. С использованием коагулометра «АПГ2-02» (Россия) определяли тромбиновое время (ТВ), активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПТВ), концентрацию фибриногена (ФГ) в плазме, активность антитромбина (АТ), XIIа-зависимый (хагеманзависимый) фибринолиз (ФЛ) с использованием реактивов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия, Барнаул). Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна–Уитни, Вальда–Вольфовитца, Уилкоксона. Для выявления связи между изучаемыми параметрами использовали коэффициенты корреляции Спирмена (R) и Гамма.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследовали влияние ЭПО на агрегацию тромбоцитов, полученных от больных ХПН, т.к. при ХПН содержание ЭПО прогрессивно снижается, что позволяет исследовать функцию тромбоцитов в условиях дефицита эндогенного ЭПО и при добавлении к ним различных концентраций экзогенного ЭПО. Установлено, что ЭПО ускоряет агрегацию тромбоцитов во всех дозах, кроме максимальной (30 МЕ/л). Ускорение агрегации тромбоцитов достигается за счет уменьшения времени процесса, а не увеличения амплитуды, более того, амплитуда процесса при этом значимо уменьшается (табл. 1). Создается впечатление, что большие дозы ЭПО оказывают ингибирующий, а малые – стимулирующий эффект на реактивность тромбоцитов. Причем по мере уменьшения дозы скорость агрегации тромбоцитов нарастает. Для выявления дозозависимого эффекта ЭПО был использован корреляционный анализ в парах «доза» – «эффект», в качестве интегрального показателя «эффекта» ЭПО использована скорость агрегации. Установлено, что скорость агрегации тромбоцитов нарастает по мере снижения дозы ЭПО (коэффициент корреляции Спирмена R = −0,44; р < 0,05).

Таблица 1

Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов больных ХПН (M ± m)

Примечание. Здесь и далее р – показатель значимости различий при сравнении с группой 1.

Для выявления эффекта ЭПО на функциональную активность тромбоцитов независимо от наличия патологии нами проведены аналитические эксперименты in vitro в условиях, аналогичных при исследовании уремических тромбоцитов (табл. 2). При этом ЭПО добавляли к интактным тромбоцитам, полученным от клинически здоровых добровольцев-доноров.

Как видно, ЭПО ускоряет агрегацию тромбоцитов при всех используемых дозах. Эффект ЭПО в одних случаях реализовался за счет увеличения амплитуды процесса, в других был связан с укорочением времени агрегации. С использованием непараметрического корреляционного анализа установлено, что скорость агрегации тромбоцитов нарастает по мере снижения дозы ЭПО (коэффициент корреляции Гамма = −0,23; р < 0,05).

Таблица 2

Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов здоровых людей (M ± m)

В аналитических условиях in vitro ЭПО изменял показатели коагуляционного гемостаза после 30-минутной инкубации с цельной кровью здоровых людей (табл. 3). Отмечено угнетение активности системы фибринолиза в связи с удлинением времени фибринолиза. Гипокоагуляционный эффект ЭПО обусловлен заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего, т.к. наряду с укорочением тромбинового времени при всех используемых дозах, наблюдалось укорочение ПТВ во всех дозах кроме минимальной (1,88 МЕ/л), и укорочение АПТВ при добавлении ЭПО в дозе 7,5 и 30 МЕ/л. Дисперсионный однофакторный анализ позволил установить, что влияние ЭПО на показатели системы фибринообразования может составить (р < 0,05): для тромбинового времени не менее 21,54 % и не более 72,28 % от общего влияния всей суммы факторов; для протромбинового времени – не менее 19,94 % и не более 64,32 % от общего влияния всей суммы факторов.

Таким образом, ЭПО ускоряет агрегацию интактных и уремических тромбоцитов; скорость агрегации тромбоцитов увеличивается по мере снижения дозы ЭПО от 30 МЕ/л до 1,88 МЕ/л. Добавление ЭПО к интактной плазме угнетает систему фибринолиза и оказывает гипокоагуляционный эффект в диапазоне доз от 1,88 до 30 МЕ/л.

Таблица 3

Влияние ЭПО на активность систем плазменного протеолиза (M ± m)

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».

Рецензенты:

Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 11.04.2013.